实验目的:1、探索Yap1对免疫原性细胞死亡和免疫识别相关分子表达的影响。2、寻找Yap1调节免疫反应的机制。3、观察辐射对Yap1表达的影响以及抑制Yap1联合放射的抗肿瘤效果。4、观察抑制Yap1对放疗-PD-1治疗抵抗肿瘤的抗肿瘤作用。实验方法:1、采用小分子抑制剂-Verteporfin或小干扰RNA（si RNA）抑制或沉默Yap1。CCK8实验确定CT26和MC38细胞Verteporfin的IC50浓度和沉默Yap1后的细胞增殖能力。Western Blot法鉴定有效的si RNA序列。2、观察抑制Yap1后CT26和MC38细胞系的免疫原性细胞死亡（ICD）情况。具体指标包括细胞凋亡,钙网蛋白（CRT）易位、ATP释放和高迁移率蛋白B1（HMGB1）分泌等损伤相关分子模式（DAMP）的表达。以及采用致死剂量Verteporfin预处理后的肿瘤细胞是否具备“免疫疫苗”能力来验证ICD诱导的作用。具体为:在体外用Verteporfin处理CT26/MC38肿瘤细胞,然后将死细胞皮下注射到BALB/c或C57BL/6免疫小鼠的左侧胁腹。8天后,再用CT26/MC38活细胞复种小鼠右侧胁腹并观察30天内右侧胁腹的成瘤情况。3、观察抑制Yap1后CT26和MC38细胞参与免疫识别相关分子的变化,包括流式细胞学检测MHC-I、MHC-II、ICAM-1和PD-L1的表达,q PCR技术检测MHC组成分子β2m、Tapbp、Tap1和Tap2的m RNA水平。4、C57BL/6小鼠胁腹皮下接种MC38细胞并给予腹腔注射Verteporfin后,采用流式细胞术检测荷瘤鼠脾脏T细胞的活化情况。5、采用免疫荧光技术观察抑制Yap1后CT26和MC38细胞DNA损伤的情况,q PCR和Western Blot技术检测先天免疫通路c GAS-STING和I型干扰素途径的改变情况;并采用慢病毒感染来沉默c GAS或STING,从而验证抑制Yap1通过该信号传导通路调控ICD和免疫应答反应。6、采用不同放射剂量（0Gy、2Gy、4Gy和8Gy）照射CT26和MC38细胞,采用Western Blot技术分析辐射对Yap1表达的影响。7、使用MC38结肠癌移植瘤模型观察抑制Yap1联合放射的抗肿瘤效果,测量肿瘤体积,观察生存时间,并采用流式细胞术对移植瘤微环境进行检测分析。8、使用Pan02胰腺癌模型观察抑制Yap1联合放射+PD-1抑制剂这一新型治疗方法对放疗、PD-1治疗抵抗型胰腺癌移植瘤的治疗效果。实验结果:1、抑制Yap1可以诱导CT26和MC38细胞凋亡,引起钙网蛋白在细胞膜外表达增多、ATP释放增多和HMGB1分泌增多。我们还观察到,在肿瘤细胞复种后30天内,用Verteporfin预处理细胞接种的小鼠右侧100%无肿瘤形成,而接种了常规培养细胞和冻融肿瘤细胞的小鼠其对侧都形成了肿瘤。2、抑制Yap1后引起了CT26和MC38细胞MHC-I、MHC-II表达上调,MHC分子相关组件β2m、Tapbp、Tap1和Tap2 m RNA水平也上调,参与T细胞活化的黏附分子ICAM-1表达增加,而参与免疫逃逸的PD-L1分子表达下调。MC38结肠癌荷瘤鼠腹腔注射Verteporfin后其脾脏CD8+T细胞表达CD69+比例增多,但CD4+T表达CD69+比例没有明显变化,提示CD8+T细胞活化增多。3、免疫荧光检测γ-H2AX显示抑制Yap1引起了CT26和MC38细胞DNA损伤增多。Western Blot技术检测到抑制Yap1后c GAS和STING表达上调,诱导IRF3磷酸化增多,IFNβm RNA水平也增加。将c GAS和STING沉默后,发现腹腔注射Verteporfin引起的荷瘤鼠脾脏T细胞活化明显减少,死剂量Verteporfin预处理诱导的免疫疫苗作用消失。4、辐射可上调Yap1的表达,且呈时间剂量依赖,8Gy照射后48小时Yap1表达水平最高。5、放射联合抑制Yap1有效地缩减了MC38移植瘤的体积,明显延长了荷瘤小鼠的生存时间。移植瘤微环境分析发现CD8+T细胞不仅数量增加,其活化程度和杀伤能力也有所提高,表现为CD69+、IFN-γ+和TNF-α+比例增加。此外,联合治疗还使得调节性T细胞（Tregs）浸润减少,肿瘤免疫应答效应得到提高。6、抑制Yap1联合放射和PD-1抗体有效地抑制了Pan02胰腺癌移植瘤的生长,显著提高了放疗和PD-1治疗抵抗型肿瘤的治疗效果。实验结论:1、抑制Yap1可引起肿瘤免疫原性细胞死亡。2、抑制Yap1可以加强对肿瘤细胞的识别,减弱免疫逃逸,增强T细胞活化。3、抑制Yap1通过c GAS-STING途径增强抗肿瘤免疫应答的作用。4、辐射可以上调Yap1的表达,放射联合抑制Yap1具有显著的抗肿瘤作用。5、抑制Yap1可有效提高对放疗和PD-1治疗均抵抗的胰腺癌治疗效果。