第一部分鼻内给予缩宫素对母婴分离应激导致大鼠抑郁样行为的影响及其机制研究背景:生命早期应激(Early Life Stress,ELS)可诱发重性抑郁症、创伤后应激障碍、儿童注意缺陷症及精神分裂症等疾病,是引发多种精神疾病的重要风险因素。近年来,随着农村外出务工人员的增加,留守儿童这一特殊群体日益受到关注。由于年龄小、缺少父母的关爱与陪伴,留守儿童容易产生自卑、胆怯、缺乏安全感、人际交往能力较差等各种问题。缩宫素(Oxytocin,OXT/OT),又称催产素,是一种由下丘脑产生的神经调节肽,能够刺激成年哺乳动物泌乳和分娩过程中子宫的收缩。多篇研究发现,OXT影响啮齿类动物和人类的社会行为。首先,OXT能促进亲社会行为的发生及抑制社会暴力。研究发现幼年时期与同龄儿童的接触可以显著提高中枢神经系统缩宫素受体(Oxytocin Receptor,OXTR)的表达。动物之间的相互舔毛等行为可以提高下丘脑视前区OXTR的表达;相反,舔毛行为较少的小鼠OXTR的表达减少。另外,大量的研究发现高水平的血浆OXT与人的信任、幸福感、夫妻关爱等相关。相反,低水平的血浆OXT与抑郁、自闭及精神分裂症有关。有研究显示新生鼠母婴分离(Neonatal Maternal Deprivation,NMD)可能会令大鼠在将来的生活中产生抑郁和焦虑症状。NMD大鼠模型是研究生命早期应激对成年动物行为影响的公认的模型之一。但目前关于OXT在早期母婴分离导致成年动物行为改变中的作用,尚未见系统报道,有待于进一步研究。该研究将为预防或治疗生命早期应激所产生的心理问题提供新的治疗手段。OXT是一个小分子九肽物质,在血浆中容易被酶降解,半衰期很短,大约2-3分钟,且很难通过血脑屏障。但是大量的动物和临床研究发现经鼻吸入OXT可以迅速通过血脑屏障到达相应脑区。另外由于脑脊液中缺乏降解酶,其半衰期可达30-60分钟。目前认为经鼻吸入可经过嗅球或三叉神经迅速到达中枢。因此,经鼻吸入OXT可能是以后预防或治疗心理性疾病比较好的途径。研究目的:本研究以NMD作为母爱剥夺的手段,观察出生早期母爱剥夺对成年大鼠行为学的影响,探讨鼻内给予OXT对NMD成年大鼠类抑郁行为及神经生成的影响,并阐明其作用机制,以期为治疗留守儿童缺乏关爱造成的心理创伤提供新的研究和治疗途径。实验方法:1.NMD大鼠模型的建立:选取SD大鼠为实验动物,出生当天定为产后第一天(PND1),将幼鼠从母鼠笼中取出,在PND2-15天每天的9:00-12:00被单独隔离3h,然后再将幼鼠送回与母鼠同笼直至断乳日(PND2-15天),构建NMD大鼠模型,而对照组幼鼠同期一直与母鼠同笼饲养。2.强迫游泳实验:将实验大鼠(n=10)单独放置于玻璃圆筒中,其内装有25℃、深度为40cm的水。大鼠不能接触圆筒底部或逃生,并被迫在筒中进行两次游泳,观察记录静止时间、游泳时间和挣扎时间。3.开放旷场实验:将一个大小为100cm×100cm×40cm方形黑色区域划分为25个等大的小正方形区域,将实验大鼠单独置于场地中央处,任其随意运动5min。观察记录大鼠水平和垂直运动的次数。4.PND50天将NMD组与对照组分别进行强迫游泳实验和开放旷场实验,观察两组大鼠行为学的异常。5.PND 52天应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测NMD大鼠(n=5)血浆、下丘脑和海马的OXT表达水平。6.鼻内给药处理:将实验NMD大鼠(n = 5)分别置于自制半封闭吸入式鼠笼中,PND 56-70天鼻内给生理盐水(NS)或OXT溶液(0.1mg/kg/d)。7.PND72天将OXT组与NS对照组NMD大鼠分别进行强迫游泳实验和开放旷场实验,观察两组大鼠的行为学特征。8.组织切片制备:在PND73天实验大鼠(n = 5)麻醉后,经0.1M冷PBS心脏灌流后,再用4%的多聚甲醛灌注、固定,30%蔗糖溶液脱水,石蜡包埋,切取厚度为60μm冰冻冠状切片。9.应用免疫荧光染色检测大鼠海马齿状回(Dentate Gyrus,DG)细胞增殖情况,共焦显微镜下计数大鼠海马DG区域Ki67和BrdU阳性细胞计数。10.统计学处理:应用Sigmaplot 10.0进行统计分析,数据以均数±标准误表示,n为每组检测样本的数量,应用配对或非配对Student’s t-检验进行两组间数据分析,单因素方差分析后进行Fisher’s最小显着性差异t检验来比较两组间Ki 67与BrdU的差异,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.NMD大鼠的行为学评估:采用强迫游泳实验评估NMD大鼠的抑郁样行为,发现与对照组相比较,NMD组大鼠(n=10)静止时间显著延长(54±4%vs 35±7%;P<0.01),挣扎时间显著缩短(37±2%vs57± 11%;P<0.01),但两组游泳时间差异无统计学意义(9±3%vs8±6%;P>0.05)。应用开放旷场实验评价大鼠自觉探索行为能力,发现NMD组大鼠在实验中穿越标记线的次数(20±8vs52±7;P<0.01)与站立次数(8±2vs21±2;P<0.01)均较对照组明显减少。2.ELISA法检测NMD大鼠OXT表达水平,发现NMD大鼠血浆(10.8±2.1pg/ml vs 15.4± 1.8 pg/ml;P<0.05)、下丘脑和海马组织中的OXT水平较对照组显著降低(0.78±0.03vs1.0±0.04及0.68±0.07vs1.0±0.09;P<0.05,n=5)。3.ELISA法检测鼻内给OXT对NMD大鼠血浆OXT的影响,发现鼻内给药后NMD大鼠血浆OXT水平明显升高(67±8pg/m1vs 22±5.3pg/ml;P<0.01,n=5),结果提示经鼻给药是有效的。4.鼻内给OXT后观察NMD大鼠抑郁样行为评估,发现强迫游泳实验中虽然OXT组与NS组游泳时间相比差异无统计学意义(11±3%vs 15±7%;P>0.05),但是静止时间明显缩短(37±6%vs 53±7%;P<0.05),而挣扎时间明显延长(52±6%vs32±4%;P<0.01),表明OXT对NMD大鼠具有明显的抗抑郁样作用;开放旷场实验结果显示OXT组NMD大鼠穿越标记线的次数显著增加(33±9vs16±7,P<0.05,n=5),而站立次数无明显变化(11±2vs9±3:P>0.05),提示OXT改善了 NMD大鼠的抑郁样行为。5.应用免疫荧光化学观察大鼠海马DG区域细胞增殖情况,发现NMD大鼠海马DG的Ki67+细胞数量显著减少(23± 11 vs 285±34;P<0.001),同时NMD组DG区域仅可见散发的BrdU+细胞,较对照组明显减少(3± 1 vs 15±4;P<0.001),表明新生儿时期的紧张刺激可致使成年大鼠新生神经元细胞数目降低。连续14天鼻内给予OXT后明显增加了 NMD大鼠DG区域Ki67+细胞的数量(97±18vs23±11;P<0.01)及BrdU+细胞数量(7±3vs3±1;P<0.05)。结论:1.新生鼠母婴分离(NMD)可诱导成年大鼠出现抑郁样行为,其机制可能与NMD大鼠血浆、下丘脑和海马组织中OXT显著降低有关。2.鼻内给予OXT能够明显改善成年大鼠的抑郁样行为,其机制可能与OXT促进海马神经元新生有关。第二部分缩宫素在慢性束缚应激促进恶性黑色素瘤肺转移中的作用及其机制研究背景:恶性黑色素瘤(Malignant Melanoma)是一·种高度侵袭性的皮肤恶性肿瘤,易发生血管浸润、转移和复发,预后极差,目前尚无有效的治疗方法。深入研究恶性黑色素瘤远处转移的机制、筛选相关分子标记物、寻找新的治疗手段,对于提高恶性黑色素瘤患者的疗效、预防肿瘤转移、改善患者预后具有重要的临床意义。有相关研究显示,应激可以促进恶性肿瘤的发生进展。慢性应激可促进乳腺癌细胞向肺脏转移;应激激素可导致非小细胞肺癌对EGFR抑制剂耐药;恶性肿瘤患者如果与社会隔离或与配偶分离,其生存率会显著下降;相反,社会支持可以改善恶性肿瘤患者的预后。近期有研究报道,慢性束缚应激通过抑制免疫系统促进恶性黑色素瘤肺转移,然而其机制尚不明确。缩宫素(OXT)是下丘脑产生的一种神经激素,在哺乳及分娩中起着至关重要的作用。此外,OXT还能调节人类情绪、社会认知、社会行为和应激相关紊乱,且多种应激刺激可导致其释放入血,因此OXT也被归类为应激激素。研究显示,暴露于重复束缚应激后血浆OXT水平明显升高。最近有研究报道,OXT通过激活缩宫素受体(Oxytocin Receptor,OXTR)抑制或促进肿瘤增殖。然而,OXT作为一种应激激素在恶性黑素瘤中的作用尚不清楚。鉴于以上研究,我们推测慢性束缚应激通过提高血浆OXT水平促进恶性黑色素瘤肺转移。研究目的:本研究拟通过小鼠慢性束缚应激模型探讨应激对恶性黑色素瘤肺转移及血浆OXT水平的影响;研究应激导致的血浆OXT升高在恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭及体外血管生成中的作用;阐明OXT通过与细胞表面OXTR结合,激活β-arrestin 2-ERK1/2信号通路,促进恶性黑色素瘤肺转移的分子机制,以期为恶性黑色素瘤的转移提供新的治疗思路。实验方法:1.建立小鼠慢性束缚应激模型,研究慢性束缚应激对血浆OXT水平及恶性黑色素瘤肺转移的影响:将C57BL/6小鼠置于特制的束缚器内,限制其行动,2小时/天,连续1周,制造小鼠慢性应激模型。尾静脉取血,ELISA试剂盒检测血浆OXT水平。小鼠接受束缚实验1周后尾静脉注射B16恶性黑色素瘤细胞,23天后颈椎脱曰法处死小鼠,解剖肺部,计数小鼠肺脏肿瘤结节数目。同样方法处理小鼠观察生存时间。2.构建恶性黑色素瘤皮下荷瘤小鼠模型及肺转移瘤小鼠模型,研究OXT对恶性黑色素瘤生长及转移的影响。将B16小鼠恶性黑色素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右后肢皮下,1周后将小鼠随机分为两组,分别腹膜腔注射OXT或生理盐水2周,颈椎脱曰法处死小鼠,解剖并观察黑色素瘤的生长情况。同样方法处理小鼠观察生存时间。肺转移瘤小鼠模型采取尾静脉注射B16细胞,3天后将小鼠随机分为3组,分别腹膜腔注射OXT、OXTR阻断剂阿托西班(atosiban)或PBS处理1周。B16细胞注射后16天处死小鼠,解剖肺部,计数小鼠肺脏肿瘤结节数目。同样方法处理小鼠观察生存时间。3.Western blot及免疫组化检测小鼠恶性黑色素瘤细胞株(B16)、人恶性黑色素瘤细胞株(A375)及人恶性黑色素瘤组织中OXT受体OXTR的表达。4.应用OXT处理B16、A375恶性黑色素瘤细胞,CCK8方法检测OXT对细胞增殖的影响。5.应用浓度梯度OXT处理B16、A375恶性黑色素瘤细胞,Transwell细胞侵袭实验及细胞划痕实验检测OXT对细胞迁移、侵袭的影响;HUVECs体外血管形成实验检测OXT对血管生成的影响。6.应用浓度梯度OXT处理B16、A375恶性黑色素瘤细胞,Western blot检测OXT处理前、后细胞中MMP-2、VEGF、pERK的表达变化;明胶酶谱分析检测OXT处理前、后细胞上清液中MMP-2的活性变化。7.应用shRNA下调B16细胞中β-arrestin 2的表达,Western blot检测OXT处理前、后细胞中MMP-2、VEGF、pERK的表达变化。8.应用shRNA下调B16细胞中β-arrestin 2或OXTR的表达,Transwell细胞侵袭实验及细胞划痕实验检测OXT对细胞迁移、侵袭的影响。9.体内实验研究下调β-arrestin 2或OXTR的表达对慢性束缚应激促恶性黑色素瘤肺转移的影响:小鼠接受束缚实验1周后尾静脉注射B16恶性黑色素瘤细胞、稳定下调OXTR或β-arrestin2的B16细胞,23天后颈椎脱曰法处死小鼠,解剖肺部,计数小鼠肺脏肿瘤结节数目;同样方法处理小鼠观察生存时间;免疫组化检测小鼠肺转移瘤组织中MMP-2、VEGF、pERK的表达变化。结果:1。慢性束缚应激能促进恶性黑色素瘤小鼠肺转移:体内实验显示,与对照组相比,束缚应激组恶性黑色素瘤小鼠肺转移瘤数量明显增多,且束缚应激组恶性黑色素瘤小鼠的生存时间明显缩短。2.慢性束缚应激能提高小鼠血浆OXT水平:ELISA结果显示,与对照组相比,暴露于慢性束缚应激后小鼠血浆OXT水平明显升高。3.恶性黑色素瘤高表达OXTR:Western blot及免疫组化显示,小鼠恶性黑色素瘤细胞株(B16)、人恶性黑色素瘤细胞株(A375)及人恶性黑色素瘤组织均高表达OXTR,提示OXT信号通路可能在恶性黑色素瘤的发生发展中发挥重要作用。4.OXT对恶性黑色素瘤细胞的增殖无明显影响:CCK8结果显示,应用OXT处理B16、A375恶性黑色素瘤细胞株后,细胞增殖与对照组无明显差异;体内研究显示,恶性黑色素瘤小鼠注射OXT后,肿瘤大小、重量、体积与生理盐水处理组无明显差异。5.OXT体外促进恶性黑色素瘤细胞的迁移、侵袭及血管生成:Transwell细胞侵袭实验及细胞划痕实验显示,OXT能显著促进B16、A375恶性黑色素瘤细胞的迁移、侵袭,并呈剂量依赖性;HUVECs体外血管形成实验显示,用OXT处理的A375恶性黑色素瘤细胞上清液在体外能显著促进HUVECs的小管形成,且呈剂量依赖性。6.OXT体内促进恶性黑色素瘤小鼠肺转移:体内实验显示,OXT处理组恶性黑色素瘤小鼠肺转移瘤数量较PBS处理组明显增多,小鼠生存时间较PBS处理组有缩短趋势;应用OXTR阻断剂阿托西班(atosiban)处理恶性黑色素瘤小鼠后,小鼠肺转移瘤数量与PBS处理组无明显差异,但生存时间较PBS处理组有延长趋势;atosiban处理组较OXT处理组小鼠肺转移瘤数量明显减少,生存时间明显延长。7.OXT促进恶性黑色素瘤细胞中MMP-2、VEGF的表达,从而激活ERK1/2:Western blot结果显示,OXT能促进恶性黑色素瘤细胞株B16、A375细胞中MMP-2和VEGF的表达,从而引起ERK1/2磷酸化增加,导致ERK1/2过度活化,该作用呈剂量依赖性;明胶酶谱分析进一步证实OXT能增加MMP-2的活性,并呈剂量依赖性。8.下调β-arrestin 2表达能抑制OXT对ERK1/2的活化:Western blot结果显示,应用shRNA干扰B16细胞中β-arrestin 2的表达后,OXT对ERK1/2的激活作用减弱,同时MMP-2和VEGF的表达降低;说明OXT对ERK1/2的活化受β-arrest:in 2的调控。9.下调β-arrestin 2或OXTR表达能在体外阻断OXT对恶性黑色素瘤细胞迁移、侵袭的促进作用:Transwell细胞侵袭实验及细胞划痕实验显示,干扰B16细胞中β-arrestin 2或OXTR的表达后,OXT对细胞迁移、侵袭的促进作用减弱。10.下调β-arrestin 2或OXTR表达能在体内抑制慢性束缚应激导致的恶性黑色素瘤小鼠肺转移:体内实验显示,干扰β-arrestin 2或OXTR的表达后,慢性束缚应激导致的恶性黑色素瘤小鼠肺转移瘤数量明显减少,小鼠生存时间明显延长;免疫组化显示,慢性束缚应激可导致小鼠肺转移瘤组织中OXTR、MMP-2、VEGF表达增加,ERK1/2磷酸化水平提高;下调β-arrestin 2或OXTR表达能使束缚应激组小鼠肺转移瘤组织中MMP-2、VEGF表达下降、ERK1/2磷酸化水平降低。结论:1.慢性束缚应激通过提高血浆OXT水平,促进恶性黑色素瘤肺转移。2.OXT能促进恶性黑色素瘤的迁移、侵袭及血管生成,对黑色素瘤的增殖无明显影响。3.OXT通过与OXTR结合,激活β-arrestin 2-ERK1/2信号通路,促进恶性黑色素瘤的肺转移。第三部分缩宫素对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及其机制研究背景:卵巢癌(Ovarian Cancer)是引起妇科恶性肿瘤患者死亡最多的疾病,约占新发死亡的5%。尽管细胞减灭术及铂类药物等己广泛应用于卵巢癌的治疗,但临床疗效仍不满意,卵巢癌的高转移率导致了卵巢癌患者的高复发率及死亡率,而且化疗药物毒副作用大。所以,目前迫切需要寻找到一种能够延缓卵巢癌进展,提高卵巢癌患者生存率的安全有效药物。缩宫素(又称催产素,oxytocin,简写OXT或OT)是一种神经激素,由下丘脑室旁核和视上核的神经元合成后,在母乳喂养及怀孕等过程中被释放,通过自分泌和旁分泌途径作用于中枢和外周器官。既往研究显示,母乳喂养与卵巢癌风险降低有关,在母乳喂养过程中OXT释放增加,因此,我们推测OXT参与母乳喂养对卵巢癌的预防作用。有研究发现OXT可抑制卵巢癌的增殖、迁移和侵袭己有报道,然而其具体机制尚不明确,亟待研究。研究目的:本研究拟探讨OXT对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及体外血管生成等生物学行为的影响,阐明OXT参与卵巢癌侵袭转移作用的具体机制,以期为母乳喂养的保护作用提供理论学依据和实验室基础,为卵巢癌的治疗提供新靶点。实验方法:1.临床相关性分析:通过 PrognoScan 公共数据库(http://gibk21.bse.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html),根据卵巢癌组织中OXTR mRNA表达水平,将卵巢癌患者分为高表达组及低表达组。应用生存曲线分析卵巢癌患者预后与OXTR mRNA表达水平的相关性。2.细胞增殖实验:2000个SKOV3细胞种入96孔板中板,加入不同浓度(0,10-7,10-6,10-5 M)OXT 或同时应用 OXTR 拮抗剂 atosiban(10-5 M)孵育48小时,应用CCK8法检测SKOV3细胞的存活,评价OXT对卵巢癌细胞增殖的影响。3.卵巢癌细胞迁移实验:将SKOV3和A2780细胞接种于6孔板中,待细胞融合率达85-90%,用100μl枪头划板,加入缩宫素,浓度梯度或时间梯度孵育后观察,评价OXT对卵巢癌细胞迁移能力的影响。4.卵巢癌细胞侵袭实验:将A2780细胞接种于transwell上孔中,加入梯度浓度的OXT(0,10-9,10-8,10-7,10-6 M)孵育,培养24小时。应用侵袭实验检测A2780细胞的侵袭,评价OXT对A2780细胞侵袭能力的影响。5.Western blot实验:应用浓度梯度OXT孵育A2780卵巢癌细胞株,首先收集细胞上清,然后使用SDS-PAGE胶,进行凝胶电泳,最后应用Western blot方法检测OXT孵育前、后A2780细胞上清中MMP2表达量的变化。收集OXT浓度梯度孵育的A2780细胞,采用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot方法检测OXT孵育前、后A2780细胞中VEGF表达量的变化。6.明胶酶谱实验:应用浓度梯度OXT孵育A2780细胞,收集细胞上清,采用含明胶的SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用明胶酶谱法检测OXT孵育前、后A2780细胞上清中MMP-2活性的改变。7.HUVECs血管形成实验:将A2780细胞接种于6孔板中,加入浓度梯度OXT(0,10-9,10-8,10-7,10-6 M)孵育,行无血清培养,获得条件培养基;将HUVECs细胞种入己铺好Matrigel胶的24孔板,加入上述条件培养基培养24h,计数HUVECs细胞管状形成数量,通过这个方式来检测缩宫素对A2780卵巢癌细胞体外血管新生能力的影响。研究结果:1.通过PrognoScan公共数据库,应用生存曲线分析发现卵巢癌组织中OXTR mRNA高表达与卵巢癌的远处转移显著相关。2.OXT抑制卵巢癌细胞增殖:应用浓度梯度的OXT处理SKOV3细胞株48小时,CCK8结果显示OXT可显著抑制SKOV3细胞的增殖,且其增殖抑制作用具有浓度依赖性。同时应用OXT(10-5M)和OXTR阻断剂atosiban(10-5M)处理,CCK8结果显示OXT的抑制增殖作用可被OXTR阻断剂所逆转。3.OXT抑制卵巢癌细胞的迁移:OXT 10-6M处理SKOV3细胞0、6、12及18小时,细胞划痕实验显示,OXT能显著促SKOV3细胞的迁移,且其迁移抑制作用具有时间依赖性。应用浓度梯度稀释的OXT处理A2780细胞24小时,细胞划痕实验显示,OXT能显著促进A2780细胞的迁移,且其迁移抑制作用具有浓度依赖性。4.OXT抑制A2780细胞的侵袭:Transwell实验结果显示梯度浓度OXT可明显抑制A2780细胞的侵袭,且其抑制作用具有浓度依赖性。5.OXT抑制卵巢癌细胞中MMP-2的表达及活性:Western blot结果显示,OXT孵育能明显抑制A2780细胞上清中MMP2表达,且具有浓度依赖性。明胶酶谱结果显示OXT可明显抑制A2780细胞上清中MMP2的活性,且其活性抑制作用亦具有剂量依赖性。6.OXT抑制卵巢癌细胞中VEGF的表达:Western blot结果显示OXT能明显抑制A2780细胞中VEGF的表达,且其抑制作用具有浓度依赖性。7.OXT抑制A2780细胞体外血管新生:HUVECs血管形成实验结果显示,OXT孵育的A2780细胞培养上清可明显抑制HUVESs细胞的管状形成,且其抑制作用具有浓度依赖性。结论:1.OXT能够抑制人卵巢癌细胞SKOV3、A2780细胞的增殖、迁移和侵袭。2.OXT通过抑制MMP-2的表达进而抑制卵巢癌侵袭转移。3.OXT通过抑制VEGF的产生抑制体外血管生成。