背景与目的：胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,占消化道恶性肿瘤的8%～10%。在恶性肿瘤中胰腺癌恶性程度较高,不易被早期发现,发展快,早期就可广泛转移,手术切除率低,术后常出现局部复发和远处转移,为致我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一。基于胰腺癌对人类健康的巨大危害性,阐明胰腺癌的发病机理,探索早期诊断胰腺癌的方法,寻找具有肿瘤治疗价值的药物靶点,是生物医学科学工作者面临的重大任务。B7-H4是最近发现的协同刺激因子B7家族新成员,通过与T细胞上的相应受体结合,抑制T细胞增殖、阻断细胞周期、使细胞停滞于G0/G1期、抑制细胞因子如IL-2等的释放。研究表明,B7-H4在一些肿瘤组织上高表达,并与临床分期和病理分级相关。B7-H4能通过抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应,逃逸机体的免疫监视。然而,除抑制免疫应答外,B7-H4在肿瘤中的异常表达是否直接影响肿瘤细胞的生物学活性?是否通过影响肿瘤细胞的信号通路调控肿瘤细胞的生长和存活,并由此促进肿瘤进展?相关研究报道很少。本课题拟重点研究B7-H4介导胰腺癌细胞恶性转化发展的病理学机制,采用细胞生物学、分子生物学、组织病理学及基因靶向表达调控等方法和技术,探讨B7-H4是否直接影响肿瘤细胞的生物学活性,参与胰腺导管上皮细胞恶性转化和胰腺癌发生、发展等病理过程,从而进一步阐明B7-H4在胰腺癌病理过程中的作用,为临床胰腺癌靶向治疗提供理论依据及实验基础。方法：1.采用杂交瘤技术,制备了小鼠抗B7-H4单克隆抗体,并分析该单克隆抗体的理化性状及功能。2.利用制备的小鼠抗B7-H4单克隆抗体,通过Western blotting、流式细胞术和免疫组化(IHC)等方法分析B7-H4在胰腺癌组织及细胞中的表达特征。3.设计并合成B7-H4特异的siRNAs并转染胰腺癌细胞L3.6p1, RT-PCR及Western blotting法验证B7-H4mRNA及蛋白的表达抑制。4.体外细胞实验：在光学显微镜下观察B7-H4表达沉默后的L3.6p1细胞形态学改变,流式细胞术和Western blotting法检测细胞表面分子(干细胞标志及上皮或间质表型标志)改变,MTS检测细胞生长增殖改变,集落试验检测细胞克隆形成能力改变,划痕愈合试验检测细胞迁移能力改变,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡,Western blotting法检测细胞信号分子(如Erkl/2、AKT等)的改变。5.体内荷瘤动物实验：将L3.6p1细胞于裸鼠皮下荷瘤,观察B7-H4siRNA处理后肿瘤的生长情况,肿瘤组织切片H&E染色观察组织病理学改变。同时采用IHC检测组织中细胞信号分子改变,用TUNEL法分析组织中细胞原位凋亡情况。6.利用miRNA表达谱芯片,结合siRNA技术,在胰腺癌细胞中,初步筛选出与B7-H4表达密切相关的几个特征性的miRNA;进而通过生物信息学方法,分析这些miRNAs在介导胰腺癌病理机制中的潜在作用及其可能的靶分子。结果：1.获得针对B7-H4的鼠源单克隆抗体：特异性抗B7-H4的单抗3E8能用于ELISA、免疫沉淀、流式细胞术及IHC等方法检测组织及细胞中的B7-H4表达。2.B7-H4在胰腺癌组织中的表达显著高于胰腺正常组织,并且B7-H4的表达水平与肿瘤的病理分级及淋巴结转移相关。3.设计合成的siRNA能有效抑制L3.6pl胰腺癌细胞的B7-H4mRNA和蛋白的表达。4.体外实验发现：①经siRNA介导B7-H4表达沉默后,L3.6pl细胞连接紧密、折光性减弱、伪足明显减少。同时,细胞上皮表型标志分子E-cadherin表达增加,间质表型标志分子Vimentin表达减少,胰腺癌干细胞标志分子CD44表达减少,提示B7-H4能诱使胰腺癌细胞形态改变。②B7-H4表达沉默后的L3.6p1细胞增殖、克隆形成和划痕迁移能力明显降低,细胞凋亡明显增加(?)究提示,B7-H4表达沉默的L3.6p1细胞中Caspases3和Casp(?)增加,凋亡促进因子Bax表达增加,凋亡抑制因子Bcl-2表达减少,同时Erkl/2磷酸化水平降低。5.体内荷瘤动物实验发现：①B7-H4siRNA处理组的L3.6p1细胞裸鼠皮下移植瘤的体积明显小于对照组。②肿瘤组织石蜡切片经TUNEL检测分析显示,B7-H4siRNA处理组的小鼠移植瘤中坏死区域周围,存在大片TUNEL阳性染色的晚期凋亡细胞,呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状(凋亡小体)。一部分未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,细胞出现邹缩、变圆、脱落。B7-H4siRNA处理组的小鼠移植瘤细胞凋亡率明显高于对照组。③肿瘤组织石蜡切片经IHC检测发现,B7-H4siRNA处理组的小鼠移植瘤中B7-H4表达较对照组明显减少,同时Bax、cleaved caspase3和cleaved caspase9表达增加,Bcl-2和磷酸化Erk1/2的表达增加。这些结果与体外细胞实验中的结果相一致。6.在B7-H4表达沉默的胰腺癌细胞中,hsa-let-7c、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-335-5p表达明显降低；而hsa-miR-299-5p、hsa-miR-483-3p表达则显著升高。结合生物信息学分析,这些表达异常的miRNA参与调控mRNA surveillance pathway和MAPK signaling pathway等细胞信号途径,进而影响胰腺癌细胞的生物学功能。结论：B7-H4在胰腺癌组织的异常表达,并与肿瘤病理分级及淋巴结转移相关,提示B7-H4可能参与胰腺癌发生发展的病理过程。胰腺癌细胞靶向B7-H4表达抑制可诱导Caspases3和Caspases9活性、抑制Erkl/2磷酸化,进而促进胰腺癌细胞凋亡、抑制胰腺癌细胞移植瘤生长等致瘤性生物学行为,佐证了B7-H4在胰腺癌发生发展中的作用。本项目研究提示B7-H4的异常表达可能促进胰腺癌生长,靶向B7-H4表达抑制技术可以有效抑制胰腺癌的病理进展,可能成为胰腺癌治疗的潜在靶点。