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背景结直肠癌是第三类常见癌症,也是世界范围内癌症死亡的第三大原因。在过去的10年中,已发现一类非编码微小RNA分子(mi RNA)在癌症发展中具有抑癌基因和癌基因的作用。已证实在结直肠癌中许多mi RNA的表达发生了变化,并且有些变化可能与通过靶向肿瘤相关基因的调控诱导肿瘤发生有关。目的研究mi RNA在人结肠癌细胞(SW480、HCT-15)和对奥沙利铂耐药的结肠癌细胞(SW480/OXA、HCT-15/OXA)中的差异化表达,对差异表达显著的mi RNA在耐药中的调控机制进行初步研究,为进一步探索有效的逆转肿瘤耐药的方法开拓新领域。方法(1)采用药物持续作用和大剂量药物间歇诱导相结合的方法,建立耐奥沙利铂的人结肠癌细胞系SW480/OXA、HCT-15/OXA。(2)利用基因芯片技术检测亲代与耐药结肠癌细胞中mi RNA的表达差异,并采用实时荧光定量PCR技术进行确证,将差异表达mi RNA的反义核苷酸和模拟物转染亲代细胞,测定其对耐药的影响。(3)采用生物信息学对耐药细胞中显著低表达的hsa-mi R-137的靶基因进行预测,利用荧光报告载体实验来验证预测靶基因,Western blot技术检测靶基因蛋白表达水平。Real-time PCR检测亲代细胞转染hsa-mi R-137-ASO后靶基因m RNA转录水平,Western blot检测蛋白水平,验证mi RNA-137对靶基因的调控作用。(4)MTT法测定结肠癌组织原代细胞对奥沙利铂耐药性,并利用实时荧光定量PCR和免疫组化法进一步研究耐药性、has-mi R-137的m RNA水平与靶基因YB-l蛋白表达水平之间的关系。结果(1)成功建立了耐受OXA的SW480/OXA和HCT-15/OXA模型,与亲代细胞相比,两株耐药细胞均产生了中度耐药,对作用机理不同的化疗药物也产生了一定的交叉耐药。(2)基因芯片检测和荧光PCR验证显示,在人结肠癌亲代细胞与耐药细胞之间,hsa-mi R-93、hsa-mi R-21、hsa-mi R-96、hsa-mi R-22、hsa-mi R-191、hsa-mi R-192、hsa-mi R-137存在明显差异性表达。MTT试验结果显示hsa-mi R-93、hsa-mi R-137、hsa-mi R-21和hsa-mi R-22具有调节OXA杀伤结肠癌细胞作用的功能。(3)mi RNA预测软件综合测定YB-l为hsa-mi R-137直接作用的候选靶基因。绿色荧光蛋白报告载体实验和实时荧光定量PCR证实,结肠癌细胞中抑制hsa-mi R-137m RNA的表达后,内源性YB-l的m RNA表达升高。Western Blot实验证实结肠癌细胞中hsa-mi R-137对YB-l蛋白表达具有负性调节作用。(4)real-time PCR显示hsa-mi R-137m RNA表达水平与结肠癌组织对OXA的敏感性密切相关,表达越高,敏感性越强。免疫组化显示,OXA敏感结肠癌组织中YB-l蛋白高表达比例较低,而耐药组织中高表达比例较高。结论(1)人结肠癌细胞OXA耐药与多种mi RNA的异常表达相关。(2)人结肠癌细胞中has-mi R-137的靶基因为YB-l,并具有负性调节作用。(3)has-mi R-137可通过靶基因YB-l调控人结肠癌细胞对OXA的敏感性。(4)结肠癌组织耐药标本has-mi R-137表达降低,YB-l蛋白增加,OXA耐药与has-mi R-137和靶基因YB-l表达密切相关。