肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝脏在受到诸如病毒、毒物、药物、酒精以及免疫等内外因素的持续刺激时引起的以细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度沉积为主要特征的慢性肝脏疾病，细胞外基质的过度沉积是肝纤维化发生的基础，而肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSCs)的激活是发生肝纤维化的中心环节。在正常情况下的HSCs处于静止状态，当肝脏受到各种致病因子刺激时，HSCs被激活转化为肌成纤维样细胞，激活后的HSCs发生一系列的变化，如大脂滴消失，细胞增殖加快，胶原开始大量沉积。与此同时，HSCs的激活伴随着“自噬潮”的发生，自噬抑制剂会在一定程度上阻止HSCs向肌成纤维样细胞的转化。自噬(autophagy)是一种细胞自我吞噬的现象，当细胞处于饥饿或应激状态下，细胞内一些功能失调或者生产过剩的细胞器会被包裹形成自噬体，这些自噬体与溶酶体融合而发生降解，降解的产物经再利用释放ATP，为细胞应对外界压力提供足够的能量。　　microRNA是一种小分子单链非编码RNA，它通过碱基互补配对与靶基因m砌NA3’非编码区(UTR)结合，抑制mRNA翻译，从而实现在转录后水平调控基因表达的效果。目前已发现成熟的miRNA有35828种，调控着人类大约1/3的基因表达。miRNA-30生物学作用十分广泛，目前诸多研究证明miRNA-30参与调控细胞增殖、分化和免疫;参与机体生长、衰老等过程的调控，并在疾病尤其在肿瘤的发生与发展过程中发挥着重要作用。miRNA-30a-5p是miRNA-30的家族成员之一，现已证实在某些肿瘤细胞中它的靶基因之一是自噬相关蛋白Beclin-1，miRNA-30a-5p通过抑制Beclin-1的表达实现对自噬的抑制作用。　　miRNA在诸多生理、病理过程中发挥着重要作用，但它与HSCs激活方面的研究甚少。对于miRNA是否可作为治疗肝纤维化的潜在方法，本实验建立了miRNA-30a-5p过表达和敲低的模型。　　目的:研究miRNA-30a-5p的表达对HSCs激活的影响，并对其机制进行初步探讨　　方法:本实验通过体外培养HSCs，应用细胞转染技术转染miRNA-30a-5p激动剂(miRNA-30a-5p mimic)和miRNA-30a-5p抑制齐0(miRNA-30a-5p inhibitor)，在细胞水平探讨miRNA-30a-5p对HSCs自噬和激活的影响。应用人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)作为自噬诱导剂，3-甲基腺嘌呤(3-MA)作为自噬的抑制剂，在miR-30a-5p作用下通过调节自噬来观察miRNA-30a-5p对HSCs激活的影响。通过real-time PCR(RT-PCR)技术检测mRNA的表达;Westem blot技术检测细胞中蛋白的变化;用吖啶橙染色法观察自噬酸性小体的形成;细胞免疫荧光化学染色法检测自噬发生时自噬标志性蛋白LC3的改变。　　结果:　　1、应用western blot技术检测PDGF干预终浓度分别为0 ng/ml组、10ng/ml组、20 ng/ml组、40 ng/ml组中细胞蛋白的表达情况。统计蛋白灰度值分析α-SMA在4组中的表达分别为0.86±0.02、0.95±0.04、1.5±0.14和1.00±0.09; Collagen-Ⅰ在4组中的表达分别为0.39±0.02、0.41±0.02、0.51±0.02和0.42±0.02; Beclin-1在4组中的表达分别为0.14±0.02、0.17±0.02、0.40±0.03和0.24±0.01; LC3BⅡ与LC3BⅠ蛋白比值在4组中的情况3.22±0.38、3.88±0.30、8.65±0.31和4.41±0.43。在PDGF终浓度为20 ng/ml时对HSCs自噬和激活的作用最明显(P＜0.05)，因此，选择20ng/ml作为本实验PDGF干预浓度。　　2、应用western blot技术检测PDGF12小时干预组、24小时干预组和48小时干预组蛋白的表达情况。统计蛋白灰度比值分析α-SMA在3组中表达分别为0.70±0.03、0.35±0.03和0.25±0.02; Beclin-1在3组中的表达分别为1.35±0.21、0.62±0.04和0.30±0.02。在PDGF干预12小时时对HSCs自噬和激活的作用最明显(P＜0.05)，因此，选择12小时做为本实验PDGF的干预时间。　　3、应用RT-PCR检测miRNA-30a-5p的表达情况，结果表明HSCs中miRNA-30a-5p在PDGF干预组的表达较对照组显著降低(0.34±0.02 vs.1.00±0.00)(P＜0.05)。　　4、应用RT-PCR检测在HSCs中转染不同终浓度（对照组、30 nmol/L组、50 nmol/L组和100 nmol/L组）的miRNA-30a-5p mimic后的转染效率，分别为1.00±0.00、3.12±0.08、3.40±0.16和6.67±0.25，结果显示在miRNA-30a-5p mimic终浓度为100 nmol/L组转染效率最高(P＜0.01)，因此，选择100 nmol/L作为本实验miRNA-30a-5p mimic的处理浓度。　　5、应用western blot技术检测HSCs中miRNA-30a-5p对照组、miRNA-30a-5p mimic组、miRNA-30a-5p对照+PDGF组、miRNA-30a-5pmimic+PDGF组细胞中蛋白的表达情况。结果显示在miRNA-30a-5p组Collagen-Ⅰ、Beclin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ的表达均较对照组显著降低（1.39±0.20vs.2.89±0.08，10.13±0.56 vs.13.19±0.44，0.15±0.04 vs.0.80±-0.08）（P＜0.05），P62表达较对照组表达升高（1.21±0.13 vs.0.97±0.01）(P＜0.05)，对HSCs进行PDGF处理后效果更明显。应用RT-PCR方法检测α-SMA、PDGFR-β、DDR2其结果与western blot结果一致。　　6、应用RT-PCR检测在HSCs中转染不同终浓度（inhibitor对照组、20 nmol/L组、50 nmol/L组和100 nmol/L组）的miRNA-30a-5p inhibitor后的转染效率，分别为1.00±0.00、0.13±0.03、0.08±0.01和0.21±0.02，结果显示在miRNA-30a-5p inhibitor终浓度为50 nmol/L组转染效率最高(P＜0.01)，因此，选择50 nmol/L作为本实验miRNA-30a-5p inhibitor的处理浓度。　　7、应用western blot技术检测miRNA-30a-5p inhibitor对照组、miRNA-30a-5p inhibitor组细胞中蛋白的表达情况。统计蛋白灰度比值，结果显示在转染miRNA-30a-5p inhibitor组中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Beclin-1的表达水平较对照组明显升高(0.07±0.01 vs.0.03±0.01,0.15±0.06 vs.0.08±0.02,0.13±0.03 vs.0.07±0.01)(P＜0.01)。　　8、应用吖啶橙染色方法检测观察miRNA-30a-5p mimic对照组、miRNA-30a-5p mimic组、miRNA-30a-5p mimic对照+PDGF组、miRNA-30a-5p mimic+PDGF组;miRNA-30a-5p inhibitor对照组、miRNA-30a-5p inhibitor组中酸性自噬囊泡的变化。结果显示miRNA-30a-5p mimic组的红色荧光较miRNA-30a-5p mimic对照组弱，在PDGF处理组对比更加显著。miRNA-30a-5p inhibitor组的红色荧光较miRNA-30a-5p inhibitor对照组明显增强。　　9、应用荧光免疫细胞化学染色检测自噬标志蛋白LC3的表达情况。结果显示miRNA-30a-5p mimic组LC3绿色荧光斑点较对照组表达量少且弥散性分布于胞浆内。　　10、应用western blot技术分别检测对照组、3-MA组中Collagen-Ⅰ、Beclin-1的表达。结果显示在3-MA干预组中Collagen-Ⅰ、Beclin-1的表达较对照组均降低（0.05±0.01 vs0.09±0.01，0.09±0.01 vs.0.19±0.03）(P＜0.05)。　　11、应用western blot技术分别检测miRNA-30a-5p inhibitor对照组、miRNA-30a-5p inhibitor组、miRNA-30a-5p inhibitor对照+3-MA组、miRNA-30a-5p inhibitor+3MA组蛋白表达，统计蛋白灰度比值，结果显示miRNA-30a-5p inhibitor组中α-SMA和LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值明显高于对照组水平（3.05±0.17 vs.1.93±0.08，0.06±0.00 vs.0.04±0.00）(P＜0.05);P62的表达水平低于对照组（1.40±0.49 vs.3.20±0.30）（P＜0.01）。而应用3-MA干预后上述蛋白变化无显著差异(1.95±0.13 vs.1.89±0.15，0.04±0.00vs.0.04±0.00,0.95±0.12 vs.1.11±0.12)(NS＞0.05)。　　12、应用生物信息学软件miRanda，Target Scan，PicTar查找miRNA-30a-5p与自噬相关的潜在靶点，筛选后取交集，确定Beclin-1为miRNA-30a-5p的作用靶点。　　结论:miRNA-30a-5p可以特异性的作用于自噬相关蛋白Beclin-1，通过减弱自噬的发生，从而抑制HSCs的激活。