高级醇作为酒类酿造过程中的副产物,其含量多少对白酒的风味和口感有重要影响。当其含量过高时会使酒体苦涩、冲辣,而且对人体健康也会产生危害。因此,控制酒中高级醇的含量对酿酒行业的发展具有重大意义。本研究主要基于酶在非水相中催化正丙醇生成相应醛、酮的原理,通过分离和纯化得到一株能够产丙醇脱氢酶的微生物,并对该酶的理化性质进行研究。在此基础上,研究构建了该酶的固定化酶和辅酶再生体系,为开发调控酒类中丙醇含量奠定基础。结果如下:1.将前期从大曲、小曲及酒醅中分离的微生物,分别采用酶标仪法和顶空气相法进行了初筛和复筛,挑选出既有乙醇耐受性,又能产丙醇脱氢酶的菌株10-F。对其进行分子生物学鉴定,鉴定结果显示10-F属于肠杆菌属(Enterobacter Hormaeche and Edwards)。该菌株能够在乙醇存在的条件下将丙醇转化为丙醛,其最佳接种量为2%,最佳培养时间和转速分别为12 h、130 r/min,最佳培养温度以及最适生长pH分别为35℃C和7.0,该菌株的最大乙醇耐受浓度为12%。2.分别考察了不同乙醇浓度、不同反应温度、不同体系pH、不同金属离子、不同培养基、不同底物以及不同辅助因子对菌株10-F所产丙醇脱氢酶酶活力的影响。结果显示,该丙醇脱氢酶的最适温度为40℃,最适pH为7.0,对环境pH的变化比较敏感,在pH5.0～7.0之间活性较为稳定,说明该酶在中性或弱酸性的环境中都可以保持较高活性,脱离此范围时环境pH对酶活有较大影响。不同乙醇浓度对丙醇脱氢酶酶活的影响也有很大差别,该酶的最高乙醇耐受浓度为10%,当乙醇浓度在0～10%范围时,随着乙醇浓度升高,对丙醇的催化能力逐渐减弱。当乙醇浓度大于10%时,基本丧失催化丙醇的能力,可能是随着乙醇浓度升高该酶对底物的特异性发生了改变。不同金属离子对酶活的影响各不相同,按照对酶活的促进作用由高到低依次为:Zn2+>Mg2+>Mn2+>Fe2+>Cu2+,特别是Zn2+对其有显著促进作用,而Cu2+对酶活则有显著抑制作用。此外,不同培养基培养的微生物对整体酶活没有显著影响。相比两种辅酶NADP和NAD+分别与丙醇脱氢酶结合后对底物正丙醇的催化能力,后者显然更具优势。3.粗酶液经过Sephadex G-100层析后,洗脱曲线出现3个吸收峰,分别测定峰值对应洗脱液的酶活发现,酶活力最高为1.76 U/ml。将该洗脱液浓缩后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果表明,目的蛋白所跑出的两条条带分子量约为35 kD和22 kD,属短链ADH同工酶,并且后者的活性更强。4.动力学研究结果显示,该酶对不同底物有不同的亲和力,当以乙醇作底物时Vmax 为 1.01 mmol/L/min,Km 值为 55.56 mmol/L。当以正丙醇作底物时 Vmax 为 1.03 mmol/L/min,Km值为125mmol/L。比较两种底物所对应的Km值可以发现,该酶对乙醇的亲和力要高于正丙醇。在不同乙醇浓度下酶对底物的特异性也有不一样,以异丙醇、正丁醇、异丁醇作底物时,酶对底物的利用情况较为相似,都是随着乙醇浓度增大,底物含量呈逐渐下降趋势,其原因可能与底物在水中的溶解度有关。当以正戊醇、异戊醇作底物时,底物含量随着乙醇浓度升高呈现先上升后下降的趋势,导致这种差异的原因可能与底物的分子量和关键基团的排列方式有关。5.将辅酶NAD和丙醇脱氢酶分别固定化,然后采用双酶包埋法将二者结合起来,并对其相关酶学特性进行探究。结果表明,固定化NAD在pH6.0时固着率最大,而固定化丙醇脱氢酶在pH6.5时酶活力最强,为117 U/ml。此外,固定化酶在35℃时稳定性最强,酶活力最大为125 U/ml。以丙醇作单一底物时,丙醇经酶催化产生丙醛。将反应后的固定化酶回收后,再以乙醛作为单一底物,结果显示当乙醛浓度为2%时,乙醛经酶催化生成乙醇,其含量达到最大为0.45 mg/L。回收后的酶再与丙醇反应后发现,丙醇仍然可以被催化产生丙醛,但其含量有所降低,因为酶在多次反应后虽然可以继续保持活性,但酶活力会随着使用次数增加而降低,综合上述结果可知经过固定化的酶可以实现循环再生。