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目的:探讨缝隙连接蛋白Connexin43（Cx43）在脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）后继发性损伤中的作用机制及外胚间充质干细胞（ecto-mesenchymal stem cell,EMSC）移植治疗的效果。方法:1.采用血肿降解产物血红素处理星形胶质细胞（Astrocyte,ASC）,建立氧化应激损伤的细胞模型,通过TAT-Gap19封闭Cx43半通道（hemichannel,HC）,CBX阻断Cx43细胞间缝隙连接通讯（gap junctional intercellular communication,GJIC）,观察对血红素hemin诱导的细胞凋亡和铁死亡的影响,并探讨可能的作用机制。2.采用干扰慢病毒敲降ASC中Cx43表达,观察细胞对hemin诱导的凋亡和铁死亡的敏感性。通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）,预测Cx43在通道功能之外参与调控细胞凋亡和铁死亡的作用机制和信号通路。3.采用细胞因子白细胞介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）,肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNF-α）和补体C1q处理ASC建立稳定的A1表型。将EMSC与A1进行共培养,观察EMSC对A1表型的逆转作用。4.建立ICH大鼠模型,将EMSC通过出血同侧的颈内动脉行血管内移植,观察对大鼠神经功能的改善情况,并且通过免疫荧光染色,观察移植细胞的迁移及转归,血肿周边ASC活化及A1表型转化情况,神经元和白质纤维损伤程度。5.采用单细胞转录组测序对体外纯化培养的EMSC进行表征,通过生信分析手段预测EMSC发挥免疫调节作用的可能机制。结果:1.在生理状态下,ASC高表达Cx43,HC处于关闭状态,细胞间通过GJIC形成合胞体样结构,对于维持细胞稳态至关重要。在受到hemin刺激后,ASC发生活化,Cx43下调,HC异常开放,GJIC功能下降,细胞发生凋亡和铁死亡。采用TAT-Gap19封闭Cx43 HC后,ASC对hemin诱导的细胞凋亡和铁死亡抵抗能力增强,而CBX阻断Cx43 GJIC后,ASC对hemin诱导的凋亡和铁死亡敏感性增加。2.采用干扰慢病毒敲降ASC中Cx43表达后,ASC对hemin诱导的细胞凋亡的抵抗能力增强而对hemin诱导的铁死亡的敏感性增加。GSEA分析发现Cx43与Hippo信号通路,铁代谢,脂质过氧化通路,缺氧应激等通路显著相关,提示Cx43在通道功能之外,还可能通过Cx43-Hippo信号通路调控脂质代谢及铁死亡。转录因子调控网络分析提示TEAD3可能参与其中。3.EMSC在体内外实验中均可以逆转A1表型。EMSC通过血肿同侧的颈内动脉移植可以向损伤区域定向迁移,并可减轻ICH大鼠的脑水肿,改善神经功能。免疫荧光染色结果显示,EMSC移植可以抑制ASC活化及A1表型转化,保护神经元和白质纤维。敲除EMSC中Cx43表达后,EMSC的上述神经保护作用被削弱。免疫荧光共定位观察结果显示移植的EMSC弥散分布于损伤灶周边的脑实质内,但本身并不能分化成神经元或胶质细胞。敲除Cx43的EMSC移植后在血肿环境中无法存活,最终发生坏死崩解并被胶质瘢痕包裹。4.EMSC的单细胞转录组测序结果显示,EMSC同时表达间充质干细胞和成纤维细胞标志蛋白的一群增殖活跃的细胞。对EMSC的细胞功能相关基因集进行GSVA分析表明EMSC在DNA复制、损伤修复、细胞间紧密连接、TGF-β信号通路相关的基因集中存在富集。结论:1.Cx43 GJIC对于维持ASC稳态至关重要,可保护细胞免受凋亡和铁死亡。Cx43 HC在生理状态下处于关闭状态,在受到hemin刺激后出现异常开放,导致细胞膜通透性增高,细胞出现凋亡和铁死亡。在ICH后针对性保护Cx43GJIC和封闭Cx43 HC有助于实现神经保护,减轻继发性氧化应激损伤。2.Cx43除了通道功能之外,还可以通过YAP/TEAD3调控细胞表型转化,细胞凋亡和铁死亡。3.Cx43具有缝隙连接通道,半通道和基因表达调控等多种功能,参与了ICH后细胞的氧化应激损伤过程。在ICH时,维持ASC中Cx43表达水平并保护GJIC,阻断异常开放的HC,有助于稳定细胞表型,减少细胞凋亡和铁死亡。4.ASC活化及A1表型转化在ICH后的继发性损伤中发挥重要作用。EMSC可以通过Cx43依赖的模式抑制ASC活化并逆转A1表型,发挥神经保护作用。TGF-β信号通路可能参与其中。5.通过颈内动脉移植EMSC可以高效的将干细胞送达损伤区域发挥神经保护作用。EMSC移植可以抑制ICH后的ASC活化及A1表型,并减轻脑水肿,保护神经元和白质纤维,这一作用依赖于Cx43的正常表达。且EMSC的Cx43表达水平对移植后EMSC的转归亦有重要影响。6.EMSC移植对ICH大鼠的神经保护作用主要依赖于Cx43介导的免疫调节功能,其本身并不能分化成神经元或胶质细胞替代受损的细胞。