研究背景及目的检测单碱基突变对实时监测肿瘤进展、治疗效果和耐药性具有重要意义。然而,利用常规聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术无法从过多的野生型背景序列中特异性地检测单碱基突变,这是因为常规设计的引物、探针无法分辨出单碱基的改变,导致最终输出的突变型信号被大量的野生型信号掩盖,影响结果的判断。目前对于单碱基突变的检测常采用测序、数字PCR（Digital PCR,d PCR）的方法,但它们的成本较高,不适合大量样本的检测。相比之下,实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,q PCR）是临床上最经典、最常用的技术,但由于常规的q PCR特异性较低,很少用于突变检测,特别是单碱基突变。近年来,随着纳米技术的发展,各种纳米材料已被用于改善PCR的扩增产量、扩增效率、扩增特异性。受此启发,我们提出了一种利用金纳米粒子（Gold nanoparticles,AuNPs）来改善q PCR特异性的单碱基突变检测方法。研究方法1.以表皮生长因子受体碱基序列中第2369位的突变（EGFR T790M）作为研究模型,在基于Taqman-MGB探针的q PCR中加入AuNPs来改善扩增的特异性。2.利用柠檬酸钠还原法制备粒径大小为13 nm的AuNPs。对制备的AuNPs进行了表征（TEM、DLS、UV-VIS、zeta电位）,并记录了扩增前后AuNPs的变化。同时,通过添加不同浓度的AuNPs来探究提高扩增特异性的最适浓度。3.将单链野生型模板和突变型模板分别与探针在60℃下孵育30分钟,再加入SYBR Green I来反映AuNPs对模板/探针的结合影响。基于上述结果,提出AuNPs提高扩增特异性的机制。4.在不同浓度范围的模板（突变型、野生型）中加入50n M的AuNPs,研究其提高单碱基突变检测特异性的模板浓度范围。5.从正常人类全血中提取基因组DNA作为野生型模板,固定其浓度,与突变型质粒DNA混合配置成不同突变丰度的模板序列,加入两种特异性探针（VIC探针和FAM探针分别于两种突变型模板和野生型模板完全互补配对）构建扩增体系。实验结果1.制备的AuNPs分散性良好、大小均一完全满足扩增的要求。以EGFR T790M为模板,50n M的AuNPs对野生型序列的背景噪声产生了显著抑制,同时几乎不影响突变型序列产生的检测信号,提高了单碱基突变检测的特异性。2.对比扩增前后AuNPs的变化,我们发现扩增后的AuNPs的紫外可见吸收光谱发生了红移,动态光散射和Zeta电位结果也发生了改变,这说明q PCR体系中的成分（酶、引物、模板等）非特异性的吸附在了AuNPs的表面。通过观察扩增后SYBR Green I的荧光强度变化,我们提出了基于能量屏障的理论,即引物和模板之间的成功配对需要跨越障碍,而添加AuNPs能够调整障碍。在最适的浓度条件下,AuNPs允许突变型序列与探针互补配对形成双链产生荧光信号,而野生型序列与探针不能完全互补配对,即使一个碱基的错配也无法形成稳定的双链结构。3.证实了AuNPs能够在10-9μM到10μM的靶序列浓度范围内提高扩增特异性,与传统的Taqman-MGB q PCR和现有PCR方法相比,可以检测到低至0.95%的突变丰度。结论实验结果证实了利用AuNPs可以有效抑制模板和探针之间的错配,从而实现高度特异性的单碱基突变分析。该方法在特异性和敏感性方面优于传统的基于Taqman-MGB探针的q PCR。考虑到在这些检测中只需要少量的AuNPs,并且AuNPs价格低廉、容易获得,目前的实验室仪器和检测方案可以很容易地适用于单碱基突变的检测。我们相信,开发的基于Taqman-MGB探针的纳米粒子辅助PCR有望成为诊断各种基因突变疾病的有力工具。