嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）常导致鱼虾等水生生物患病,这不仅给沿海地区的经济造成损失,且制约水产养殖业的长久可持续发展。A.hydrophila的致病性是复杂、多因素的,主要通过产生和分泌相关毒力因子导致宿主患病。其中,溶血素基因（ahh1）在A.hydrophila感染宿主过程中起重要作用,阐释其功能及作用机理对于病害防治及疫苗开发具有现实意义。本课题首先通过原核表达获得重组溶血素蛋白,经Ni-NTA树脂纯化并通过尿素梯度透析获得纯化的复性溶血素蛋白。复性后的溶血素可在血平板上可形成溶血环,其溶血率最高为170%,蛋白稀释64倍时仍可检出溶血率为18%,表明溶血素具有较高活性。将溶血素免疫新西兰大白兔以制备高特异性的兔源溶血素多克隆抗体。为了检测溶血素的免疫效果,将溶血素免疫锦鲤后采集血清并检测超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）及过氧化氢酶（CAT）的活性变化,结果表明各免疫组血清酶活性在免疫初期变化较为明显,免疫14天达到最大值,此时与对照组相比,SOD活性高1.9倍,LZM活性高3.8倍,CAT活性1.7倍;其后各酶活性呈现波动变化,但仍显著高于对照组,表明溶血素具有较好的抗原性,可刺激机体产生免疫反应。为了深入探究溶血素感染宿主的分子机制,对感染溶血素14天的锦鲤脾脏进行转录组测序。筛选获得1982个差异表达基因（DEGs）,其中1083个基因表达量上调,899个基因表达量下调。其中,与炎症相关的IL-8、TLR5、CTSK、CXCL9等基因的表达水平显著上调,进一步分析发现DEGs主要富集于IL-17和Toll样受体等信号通路,表明溶血素的刺激可引发机体炎症反应,激活免疫系统;另一方面,分析发现MHC1、MHC2及STAT2等分子的表达量异常下调,提示溶血素在逃避宿主免疫方面发挥作用。随机选取7个免疫相关基因进行q RT-PCR实验以验证RNA-seq数据的准确性,结果表明候选基因的表达趋势与测序数据一致,表明测序数据准确可靠。为了研究溶血素基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建溶血素敲除质粒:以BPK764为骨架载体偶联sg RNA元件及同源修复臂构建单质粒敲除系统;将含有靶位点的sg RNA表达质粒p Target F-ahh1,通过同源修复臂,运用CRISPR/Cas9系统偶联λ-Red重组酶构建双质粒敲除系统。结果显示单质粒/双质粒敲除载体构建成功,但有关于敲除质粒的转入方式及敲除效率的提高仍有待进一步研究。本论文的研究阐释了溶血素在锦鲤感染免疫中的功能,明确锦鲤对溶血素免疫应答的关键基因及通路,构建敲除ahh1基因的单质粒和双质粒系统。这不仅为深入解析溶血素的作用机制奠定了较好的理论基础,且对有效防控A.hydrophila引起的病害具有现实意义。