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目的:30年余来,艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）在全世界范围内蔓延,已成为危害人类健康的重大传染病之一。虽然高效联合抗病毒治疗（Highly Active Anti-Retroviral Therapy,HAART）已被广泛应用于HIV感染的治疗,但HAART治疗需要每日服药,给患者带了一定的精神和经济负担,另外HAART带来的潜在耐药风险,及药物的不良反应也影响抗病毒治疗药物的应用,而且由于病毒储存库的存在,即使长期服药最好的抗病毒药物也不能清除HIV,不达到治愈的目的,因此有效的抗HIV疫苗仍是有望根治HIV的关键。迄今为止,虽然有多项HIV疫苗项目已推进到临床实验阶段,但均没有取得可喜的结果,在长期HIV疫苗研究过程中,研究者们分离出许多高效广谱的抗HIV中和抗体,多项基于这些抗体或抗体衍生物的被动免疫策略在HIV预防和治疗上具有一定的效果。虽然相比于抗病毒药物,抗体发挥抗病毒作用时效较长,不需要日日给药,但仍需要多次给予抗体,才能在体内达到维持数周的有效抗病毒浓度。因此如何保证体内,尤其是感染部位（黏膜）长期存在足够的有效抗体是抗HIV被动免疫疗法亟需解决的关键问题。乳酸杆菌作为食品级的人类胃肠道及女性生殖道定植的有益菌群,其食品安全性及在黏膜稳定定植的特征,使其在黏膜表面作为活疫苗的呈递载体及外源蛋白表达载体得到广泛的关注和认可。利用乳酸杆菌黏膜定植的特性,基因工程化重组菌,使抗HIV-1特异性抗体或其类似物在黏膜表面能够伴随乳酸杆菌的定植、生长和繁殖而持续发挥抗病毒作用,有望成为进一步提高基于中和抗体的HIV被动免疫防治效果的重要手段。近年来性途径传播已超过采供血途径传播成为HIV传播的主要途径,在我国,男男同性传播比例更明显增长,男性直肠黏膜成为当前HIV首要攻击的部位,同时也成为有效阻断及预防感染的关键环节。本研究把中和抗体或其类似物与直肠黏膜共生菌植物乳酸杆菌WCFS1表达系统相结合,使功能性的中和抗体随乳酸杆菌的定植在黏膜局部稳定分泌,长期维持其在HIV攻击部位的有效浓度,以达到有效预防HIV传播和延长服药周期的理想效果,为被动免疫、靶向阻断HIV黏膜传播的防治策略提供一定的技术支持,所构建的乳酸杆菌活载体表达系统提高了抗体药物在预防HIV黏膜感染中的应用价值。研究方法:本研究第一部分为构建及优化乳酸杆菌表达系统,实现外源蛋白的高效表达。本研究基于目前男男性行为人群HIV-1感染率高的现状,选择人直肠黏膜常驻菌-植物乳酸杆菌WCFS1作为宿主菌,以及红霉素抗性的、同时具有乳酸杆菌和大肠杆菌复制子的乳酸杆菌表达质粒plp0373Amy为骨架质粒。为便于在大肠杆菌中进行质粒克隆和改造,首先构建双抗性乳酸杆菌表达质粒,用于在氨卞青霉素条件下,以大肠杆菌作为宿主菌进行质粒改造。为提高基于乳酸杆菌质粒的外源蛋白的表达,构建基于同源信号肽和启动子的乳酸杆菌表达质粒,并利用网络工具SignalP预测信号肽剪切位点,以便更为准确估计分泌蛋白大小。本研究中目标抗体是基于前期真核表达系统筛选出的具有较好协同中和作用的两个HIV-1单链抗体（它们分别针对HIV-1包膜蛋白gp120的v3区糖基化位点,和细胞CD4辅助受体的domain 2区）,以及体外通过linker（4个GGGGS）把两个单链抗体连在一起构建成单基因表达的双特异性单链抗体。通过分子克隆把抗体基因插入到乳酸杆菌表达载体,同时为方便后续实验,在抗体表达元件的3’端加上6xhis标签。电转植物乳酸杆菌WCFS1感受态细胞,筛选出能够表达中和抗体的重组乳酸杆菌,收集并浓缩培养上清。本研究第二部分为鉴定重组菌生长活性以及分泌抗体的生物学活性。通过ELISA和WB证明各重组菌分泌上清中中和抗体的存在和表型,并在体外通过多个亚型的国际标准毒株中和实验证明各重组菌分泌上清的中和能力和中和宽度。检测重组菌的成长能力和活性,即挑单个菌落在MRS培养基培养24小时,测菌液OD600;挑单个菌落,在MRS培养基培养24小时后,菌液10倍梯度稀释后涂板培养40小时后进行菌落计数,计算CFU/ml。本研究第三部分为体外验证重组菌在直肠黏膜细胞上的定植能力及有无对黏膜的损伤。利用正常人直肠黏膜FHC细胞模型,收集细菌定植黏膜24小时后的黏膜上皮细胞,计算与黏膜细胞相关的乳酸杆菌的数目;收集细菌定植黏膜24小时后的黏膜上皮细胞,用荧光素酶检测试剂盒检测细胞凋亡情况。收集细菌定植黏膜24小时后的培养上清,利用细胞因子ELISA检测试剂盒,检测上清中4种前炎症因子的水平,即IL-1a,IL-6,IL-8和TNF-a,以及抗炎症保护因子IL-1RA的水平。结果:1、构建了基于同源信号肽和启动子的乳酸杆菌表达质粒pldhl0373AmyA,把中和抗体基因插入表达质粒后,构建了含有HIV特异性抗体基因的表达质粒,即pldhl0373PGT128scFv,pldhl0373Hu5A8scFv和pldhl0373biscFv。经电转和抗生素筛选,获得能够分泌HIV特异抗体的植物乳酸杆菌WCFS1重组菌。2、重组菌分泌上清经蛋白纯化,通过ELISA实验,证明上清中存在HIV特异性抗体;通过WB验证单特异性抗体大小约为25kDa,双特异性抗体大小约为50kDa,与预期相符。通过对多个亚型HIV-1假病毒中和实验,发现各重组菌培养上清均具有中和能力。单个菌落在MRS培养液培养24小时后,各重组菌与野生菌菌液OD600值水平相当;把培养24小时菌液梯度稀释后涂板培养40小时,野生菌和重组菌每ml菌落计数相当,双特异抗体重组菌稍微少些,可达到108,证明重组菌具有与野生菌相似的生长能力及活性。3、乳酸杆菌与人直肠黏膜上皮细胞共培养24小时后,每平方厘米黏膜上皮细胞可定植105 CFU的植物乳酸杆菌,重组菌和野生菌在黏膜上皮细胞定植水平相当;野生菌和重组菌定植于黏膜细胞后都能够诱导细胞凋亡,重组菌诱导的细胞凋亡更为明显,各重组菌诱导的凋亡水平相当,但均低于阳性对照,证明重组菌定植黏膜后不会诱导菌株特异性的细胞凋亡;乳酸杆菌与人直肠黏膜上皮细胞共培养24小时后的培养上清中未见细胞因子IL-1a、IL-1RA、IL-6、IL-8和TNF-a表现出明显的上调或下调,均与阴性对照相当,其中TNF-a,IL-6和IL-8水平均低于阳性对照,但IL-1a和IL-1RA水平与阳性对照相当,证明与野生菌相比,重组菌不会诱导明显的炎症反应。结论:1、本研究构建的重组乳酸杆菌能分泌对多个亚型HIV-1假病毒具有中和作用的单链抗体。2、重组乳酸杆菌具有正常的生长活性和黏膜定植能力,不会诱导明显的菌株特异性细胞凋亡和炎症反应,证明其稳定性和安全性。3、基于乳酸杆菌黏膜定植特性,重组菌可在黏膜部位分泌HIV单链抗体、维持长期、有效的抗体浓度。4、本研究提出一种以重组乳酸杆菌为媒介、分泌抗病毒蛋白,以预防HIV同性传播的新模式。