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目的1初步探索Nrf2信号通路在t-BHP致HEI-OC1细胞氧化损伤中的作用。2探讨原花青素在t-BHP致HEI-OC1细胞氧化损伤中的作用及机制。方法1采用t-BHP染毒HEI-OC1细胞,设置对照组与50μM、100μM、200μM三个染毒组,于染毒12h后分别检测细胞生存率(CCK-8法)、检测细胞内ROS水平(流式细胞术)及细胞凋亡率,验证氧化损伤模型是否构建成功。2进行实时荧光定量PCR试验,检测氧化损伤模型下HEI-OC1细胞中Nrf2、HO-1、GSTα1、GCLC、GCLM、NQO1 m RNA的表达水平。3应用Western Blot试验检测氧化损伤模型下HEI-OC1细胞中HO-1、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。4使用CCK-8法进行细胞毒性试验,分别观察原花青素对正常状态下HEI-OC1细胞生存率的影响以及原花青素对氧化损伤模型下HEI-OC1细胞生存率的影响,从而筛选出较适宜的原花青素作用时间及药物浓度。5对原花青素干预后的HEI-OC1细胞进行流式细胞试验,用DCFH-DA探针法检测HEI-OC1细胞内ROS水平,Annexin V-FITC/PI双染法检测HEI-OC1细胞凋亡情况。6对原花青素干预后的HEI-OC1细胞进行实时荧光定量PCR试验,分别检测HEI-OC1细胞中Nrf2、HO-1、GSTα1、GCLC、GCLM、NQO1 m RNA的表达水平。7通过Western Blot试验检测原花青素干预后的HEI-OC1细胞中HO-1、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。结果1 CCK8检测结果显示随着t-BHP染毒浓度的增加,细胞的增殖能力呈明显的下降趋势(F=322.8,P<0.001)。DCFH-DA探针标记和Annexin-V/PI双染流式细胞术检测结果显示随着t-BHP染毒浓度的增加,细胞内ROS水平增加,细胞的早期凋亡率与晚期凋亡率也呈一定的升高趋势。2 RT-PCR结果表明,HO-1、GCLC、GST-α1基因表达水平升高,并随着t-BHP染毒浓度的增加,基因表达水平呈现一定的升高趋势;Nrf2、GCLM基因表达水平在200μM时有统计学差异(F=10.39,P<0.01;F=13.33,P<0.01);NQO1基因表达水平升高,但仅在100μM时有统计学差异(F=4.77,P<0.05)。3 Western Blot结果表明,cleaved-caspase-3、Bax、HO-1蛋白表达的水平随着t-BHP染毒浓度的增加呈现一定的升高趋势(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平降低。4 CCK8法检测细胞存活率,结果显示,与对照组相比,0-20mg/L的原花青素(PC)对细胞存活率无明显改变,而40、80mg/L的原花青素显著降低细胞存活率(85.66±3.0,39.74±2.04,F=311.3,P<0.001)。在氧化损伤细胞模型中,加入不同浓度PC干预6、12、24h后,干预12h时,不同浓度的PC对细胞保护作用呈现一定的增强趋势,20mg/L PC对细胞保护作用相对较大(F=26.23,P<0.001)。5 DCFH-DA探针标记和Annexin-V/PI双染流式细胞术检测结果显示,原花青素干预后,原花青素各组(5、10、20mg/L)细胞内ROS荧光Mean值分别是损伤组的0.82倍(P<0.05)、0.70倍(P<0.001)、0.56倍(P<0.001)。原花青素各组(5、10、20mg/L)凋亡区细胞分别为损伤组的0.55倍(P<0.001)、0.64倍(P<0.001)、0.85倍(P<0.05)。6 RT-PCR结果表明,给予原花青素干预后,仅HO-1、GCLM、GST-α1 m RNA表达水平升高,且在低浓度干预下有统计学差异(P<0.05)。与损伤组相比,NQO1、GCLC、Nrf2 m RNA随着干预浓度的增加呈现一定的降低趋势。7 Western Blot结果表明,原花青素干预后Bcl-2、HO-1蛋白表达的水平随着染毒浓度的增加呈一定的升高趋势(P<0.05),cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平降低。结论1 t-BHP可诱导HEI-OC1细胞发生氧化应激反应,并导致细胞凋亡。2 t-BHP通过激活Nrf2/ARE信号通路,促进其下游保护基因的表达。3原花青素可能通过抑制线粒体凋亡途径而对HEI-OC1细胞起到保护作用。