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海藻糖是一种非还原性二糖,它广泛存在于自然界中,具有独特的理化性质和生物学功能,使其在食品工业、化妆品工业、医药工业、农业、分子生物学等领域有广泛的应用前景。海藻糖合成酶能够通过分子内的转糖苷作用转化麦芽糖生成海藻糖,是海藻糖合成最重要的途径之一。利用PCR技术从恶臭假单胞杆菌S1中成功扩增出海藻糖酶基因(treS)基因。通过TA克隆,将扩增片段与pMD19-T载体连接,转化E. coli JM109,蓝白斑筛选阳性菌落,得到重组质粒pMD-TS2。质粒经酶切鉴定、测序后,用BamHI、HindⅢ同时双酶切重组质粒pMD-TS2和表达载体pQE30T,在T4DNA连接酶作用下,构建重组质粒pQE-TS2。酶切鉴定后,将重组质粒pQE-TS2转化E. coli M15并进行了IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析,酶蛋白的分子量大小为77KD,但主要以包含体的形式存在于宿主细胞中。通过在摇瓶条件下的优化,得到最佳培养和诱导条件为:37℃菌体生长至OD600≈0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.01mmol/L,20℃诱导20h,目的蛋白的表达量达可占可溶性总蛋白18.6%,发酵液酶活达到1.9U /mL,为原始菌株的50倍。通过单因素优化实验,得到经济适用、易于扩大培养重组菌的培养基配方:葡萄糖10 g/L,硫酸铵3 g/L,蛋白胨1.5g/L,柠檬酸1.5g/L,磷酸二氢钾12.5 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,TES 5 mL/L,pH为7.0。在5 L台式搅拌发酵罐中,控制溶氧在30%以上,重组菌的对数生长中期流加碳源和氮源,发酵结束菌体干重为17.2g/L,目的蛋白的表达量占胞内可溶性蛋白的10.2%,单位体积内高密度发酵的海藻糖合成酶表达量是摇瓶发酵的6.9倍。重组海藻糖合成酶能够一步法将底物麦芽糖转化成海藻糖。通过对缓冲液pH,温度,反应时间,底物浓度,加酶量对麦芽糖转化率的影响研究,得到了该酶最适pH 8.5,最适温度20℃,在30℃以下和pH7.5~9.0之间保持较好的稳定性,并需在低温下保存。通过正交实验考察加酶量、pH、底物浓度、反应温度等因素,确立了海藻糖合成酶最佳的转化条件为:在10℃、pH8.5条件下反应36h、加酶量是6U/g麦芽糖,按此可以获得70.1%的海藻糖产率。