论文部分内容阅读
心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是一种常见的心血管疾病,也是心力衰竭(Heart failure,HF)的主要因素,具有较高的发病率和死亡率。MI发生后,心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)被激活,随后持续增殖并合成、分泌胶原蛋白。这些胶原蛋白形成细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),在维持心脏的结构完整及避免左心室损伤中发挥重要功能。然而,当CFs细胞过度增殖时,会导致胶原蛋白的过度合成、分泌和沉积,诱导心肌纤维化的发生,并最终导致心肌弹性受损和HF。尽管CFs细胞增殖和胶原合成在MI诱导的心肌纤维化中的作用已被广泛研究,但调控CFs细胞增殖和胶原合成的机制尚不明确。肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白1(Tumor protein p53-induced nuclear protein 1,TP53INP1)是一个压力诱导基因,能抑制CFs细胞的增殖和胶原蛋白合成。c-Myc是一个原癌基因,不仅参与多种癌症的发生发展过程,在缺血性心肌病、心肌肥厚以及糖尿病性心肌病等心血管疾病中也发挥重要的调控作用。此外,已有研究证实,c-Myc能在食管癌中抑制TP53INP1的表达。然而,c-Myc是否能通过TP53INP1调控CFs的增殖和胶原合成进而影响心肌纤维化进展尚不清楚。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一种非编码的小分子RNA,近年来的研究发现,miRNA也广泛参与多种心血管疾病的病理发生过程。本研究中,我们将建立MI诱导的小鼠心肌纤维化模型(体内)以及转化生长因子β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)或血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)诱导的心肌纤维化体外模型,采用HE染色、免疫组化染色、细胞转染、荧光素酶报告基因实验、MTT实验、实时定量荧光PCR(qRT-PCR)和western blot等多种生物学技术探究miR-142-5p和miR-212-5p在MI小鼠心肌纤维化中的功能及其机制,以期为MI后心肌纤维化的病理机制积累更多资料,并为心肌纤维化的诊断和治疗提供有效的分子靶点。第一部分miR-142-5p和miR-212-5p在心肌纤维化中表达下调目的:miR-142-5p和miR-212-5p参与心血管疾病的发生发展过程。本研究拟探讨miR-142-5p和miR-212-5p在体内和体外心肌纤维化模型中的表达情况。方法:通过冠状动脉左前降支结扎术建立MI诱导的小鼠心肌纤维化模型;分离小鼠原代CFs细胞,并用TGF-β1和Ang II进行诱导,建立体外心肌纤维化模型;超声心动图检测小鼠左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS);HE染色行心肌组织病理学观察;Collagen I和Collagen III免疫组化染色评估小鼠心肌组织纤维化情况;qRT-PCR和western blot检测小鼠心肌组织以及CFs细胞中Collagen I、Collagen III、miR-142-5p和miR-212-5p的表达水平。结果:1.超声心动图结果显示,MI小鼠的LVEF和LVFS显著降低。2.HE染色结果显示,小鼠的心肌纤维结构松散紊乱,胶原分布面积较大,心肌细胞变性、肥大,甚至破碎。3.免疫组化和western blot结果显示,MI小鼠心肌组织中Collagen I和Collagen III的表达量增加。4.MI模型建立7d,14d和28d后,小鼠心肌组织中miR-142-5p和miR-212-5p的表达下调。5.TGF-β1和Ang II刺激后,CFs细胞中miR-142-5p和miR-212-5p的表达下调。结论:1.MI小鼠的心功能受损,心肌组织发生纤维化。2.miR-142-5p和miR-212-5p在MI诱导的小鼠纤维化模型以及TGF-β1和Ang II诱导的体外心肌纤维化模型中表达下调。第二部分miR-142-5p和miR-212-5p抑制小鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原生成目的:CFs细胞的增殖和胶原合成是心肌纤维化发生的重要过程。本研究旨在探究miR-142-5p和miR-212-5p是否能影响小鼠CFs细胞的增殖和胶原合成。方法:分离小鼠原代CFs细胞,并在CFs细胞中过表达miR-142-5p和miR-212-5p,随后用TGF-β1和Ang II处理CFs细胞,建立心肌纤维化体外模型;采用MTT实验检测CFs细胞的增殖情况;采用western blot检测CFs细胞中Collagen I和Collagen III的蛋白水平。结果:1.miR-142-5p或miR-212-5p单独或者同时过表达抑制TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞的增殖。2.miR-142-5p或miR-212-5p单独或者同时过表达抑制TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞中Collagen I和Collagen III的表达。结论:miR-142-5p和miR-212-5p共同抑制TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞的增殖和胶原合成。第三部分miR-142-5p和miR-212-5p通过c-Myc/TP53INP1通路抑制CFs细胞增殖和胶原生成目的:TP53INP1能抑制CFs细胞的增殖和胶原生成,而c-Myc能抑制TP53INP1的表达。本研究拟探究miR-142-5p和miR-212-5p是否通过靶向c-Myc调控TP53INP1的表达,进而影响CFs细胞的增殖和胶原生成。方法:采用生物信息学软件Target Scan预测c-Myc的3’非翻译区(3’-Untranslated region,3’-UTR)是否存在miR-142-5p、miR-212-5p的结合位点;分离小鼠原代CFs细胞,并在CFs细胞中过表达miR-142-5p、miR-212-5p或c-Myc,或者干扰miR-142-5p和miR-212-5p,随后用TGF-β1和Ang II诱导CFs细胞,建立心肌纤维化体外模型;采用共转染和荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p和miR-212-5p靶向c-Myc;采用MTT实验检测CFs细胞的增殖情况;采用qRT-PCR检测CFs细胞中c-Myc的m RNA表达水平;采用western blot检测CFs细胞中Collagen I、Collagen III、c-Myc和TP53INP1的蛋白水平。结果:1.生物信息学分析结果显示,miR-142-5p和miR-212-5p均位于小鼠的11号染色体上,且c-Myc 3’-UTR上存在miR-142-5p和miR-212-5p结合位点。2.荧光素酶报告基因实验的结果显示,miR-142-5p和miR-212-5p单独过表达或同时过表达均能显著抑制野生型c-Myc 3’-UTR的荧光素酶活性;miR-212-5p单独过表达或miR-142-5p和miR-212-5p同时过表达能显著抑制miR-142-5p结合位点突变的c-Myc 3’-UTR的荧光素酶活性;miR-142-5p单独过表达或miR-142-5p和miR-212-5p同时过表达能显著抑制miR-212-5p结合位点突变的c-Myc 3’-UTR的荧光素酶活性;miR-142-5p和miR-212-5p单独过表达或同时过表达对miR-142-5p和miR-212-5p结合位点均突变的c-Myc 3’-UTR的荧光素酶活性无显著影响。3.miR-142-5p和miR-212-5p过表达降低TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞中c-Myc的m RNA和蛋白水平。4.miR-142-5p和miR-212-5p沉默增加CFs细胞c-Myc的m RNA和蛋白水平。5.miR-142-5p和miR-212-5p过表达促进TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞中TP53INP1的表达,c-Myc过表达逆转这种影响。6.miR-142-5p和miR-212-5p过表达抑制TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞的增殖,而这种抑制作用被c-Myc所取消。7.miR-142-5p和miR-212-5p过表达抑制TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞中Collagen I和Collagen III的表达,而这种抑制作用被c-Myc所逆转。结论:1.miR-142-5p和miR-212-5p靶向c-Myc。2.miR-142-5p和miR-212-5p负调控CFs细胞中c-Myc的表达。3.miR-142-5p和miR-212-5p抑制c-Myc/TP53INP1通路。4.miR-142-5p和miR-212-5p通过c-Myc/TP53INP1通路抑制TGF-β1和Ang II诱导的CFs细胞的增殖和胶原合成。第四部分过表达miR-142-5p和miR-212-5p缓解MI小鼠的心肌纤维化目的:本研究拟在体内验证miR-142-5p和miR-212-5p对MI诱导的小鼠心肌纤维化进程的影响。方法:通过冠状动脉左前降支结扎术建立MI诱导的小鼠心肌纤维化模型;MI小鼠左心室腔内注射miR-142-5p和miR-212-5p的慢病毒过表达载体(LV-miR-142-5p和LV-miR-212-5p);超声心动图检测小鼠的LVEF和的LVFS;qRT-PCR检测小鼠心肌组织中miR-142-5p和miR-212-5p的表达水平;western blot检测小鼠心肌组织中Collagen I、Collagen III、c-Myc和TP53INP1的蛋白水平。结果:1.miR-142-5p和miR-212-5p过表达使MI小鼠的LVEF和LVFS增加。2.miR-142-5p和miR-212-5p过表达降低MI小鼠心肌组织中Collagen I、Collagen III和c-Myc的蛋白水平,增加TP53INP1的蛋白水平。结论:1.miR-142-5p和miR-212-5p过表达改善MI小鼠的心功能。2.miR-142-5p和miR-212-5p过表达抑制MI小鼠心肌纤维化。