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蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,PG）是一种新型脱酰胺酶,可作用于蛋白质谷氨酰胺基团,将其转变为谷氨酸,并释放氨。脱酰胺可以增加蛋白质中带负电荷的羧基数,降低等电点,因而PG可作为食品蛋白加工中的助溶剂。此外,脱酰胺可改善蛋白质的两亲性,使其三级结构发生改变,可用作食品工业上的乳化剂或发泡剂。同时,PG已被证明是无致病性和诱发性,安全性高。因此,作为一种蛋白质加工助剂,PG在食品改性领域备受关注。然而,目前PG的产生菌株野生型解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的PG分泌量过低,限制了其工业化生产与应用。同时,关于PG的蛋白含量测定方法尚不完善。另外,目前有关PG发酵代谢途径方面的研究甚少。因而,本研究首先建立PG的免疫学检测法,然后采用复合诱变方法选育PG高产菌株,并在不同发酵状态下对高产菌株的特性进行分析,初步探究氨对PG代谢调控的影响,为深入研究其代谢途径奠定了基础。本课题主要研究内容如下:1.蛋白质谷氨酰胺酶免疫学检测方法的建立为了建立蛋白质谷氨酰胺酶蛋白的检测方法,首先从解朊金黄杆菌基因组中扩增出成熟肽基因mpg,将其与p ET32a（+）载体连接构建重组质粒p ET32a（+）-mpg,转化至大肠杆菌BL21（DE3）。在25℃条件下,经IPTG诱导6 h,m PG-His6表达量最高、呈可溶性蛋白。对重组蛋白m PG-His6进行纯化,将其作为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体。ELISA检测其效价为1:5000,可用于后续实验。使用该多克隆抗体对解朊金黄杆菌的发酵上清液进行蛋白质免疫印迹反应,结果表明该抗体特异性良好,可用于半定量检测解朊金黄杆菌分泌的PG。2.采用复合诱变方法展开多轮诱变选育高产菌株建立紫外光修复诱变方法和亚硝酸钠-紫外（NIT-UV）两种复合诱变方法,基于致死率和正突变率优化多个诱变条件,最终确定复合诱变方案。其中紫外光修复诱变最佳条件如下:将菌液调节OD600=1,第一次紫外光处理10 s、日光灯处理25 s、第二次紫外光处理15 s。确定亚硝酸钠-紫外复合诱变最佳条件为:NIT作用最佳浓度为0.02mol/L,NIT作用最佳时间为4 min,UV照射最佳时间为6 s。以NTG-Q0314为出发菌株,用上述优化的最佳复合诱变方法,共进行十轮递推式诱变育种,对17783个突变株进行48孔板初筛,再经48孔板复筛、试管复筛和摇瓶复筛,最终得到高产菌株NIU-T1040,PG酶活为3.32 U/m L。与出发菌株的PG酶活1.22 U/m L相比,其酶活提高了172.13%。3.高产PG菌株的特性探究在获得高产菌株的基础上,进一步研究该高产菌株的特性。从四个层次,即生长代谢水平、基因水平、转录水平和蛋白表达水平,对高产菌株特性进行探究。研究结果表明,在高氨环境下高产菌株的产酶最高点酶活性为1.79 U/m L。在低氨环境中,两株菌的PG酶活性均显著提高,高产菌株的酶活性达到3.37 U/m L,并且对氨的耐受性大大提高。PG基因序列结果表明PG基因本身未发生突变。PG转录水平结果表明低氨环境可整体提高出发菌株和高产菌株的PG基因转录水平,但其对氨的响应程度存在差异。在高氨环境下,与出发菌株相比,16 h时,高产菌株的PG转录水平上升13.39倍。在低氨环境下,16 h时,高产菌株的PG转录水平比出发菌株显著提高4.86倍。蛋白表达水平上SDS-PAGE和Western blotting结果均表明高产菌株的PG蛋白表达量显著提高。4.氨对蛋白质谷氨酰胺酶代谢调控的影响根据高产菌株的特性探究,可知氨对PG酶活具有重要影响。因而,初步探究氨对PG的影响,结果表明氨对PG酶促反应的抑制影响较弱,主要是抑制菌株发酵过程中PG的代谢。分析野生株QSH1265的全基因组序列,结合KEGG分析氮代谢通路中氨的主要代谢途径,找到谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）以及谷氨酸合成酶（GOGAT）三个关键的限速酶;以及一个氨转运蛋白（AMT）,负责氨在胞内外的跨膜运输。荧光定量PCR检测分析比较这四个基因的转录水平,结果表明低氨环境能够提高AMT、GDH、GS以及GOGAT的转录水平,提高高产菌株的氨代谢调节,进一步促进PG的代谢合成。本研究首先建立蛋白质谷氨酰胺酶的免疫学检测法,采用两种复合诱变方法选育PG高产菌株,探究两种培养环境下高产菌株的特性,包括生长代谢水平、PG基因水平、PG转录水平、PG蛋白水平等,继而从转录水平上初步探究氨对高产菌株分泌PG的影响,为以后定向改造菌株,以及合理优化培养基,实现PG产量的提高奠定基础。