【摘 要】
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鸭瘟是雁翅目动物中一种常见的传染病,主要感染鸭、鹅等,其病原体为鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）,其高传染性、高致死率的特点对世界各地的养鸭、养鹅业带来了严重的经济损失。全基因组测序分析表明,DPV弱毒株的US10基因较强毒株缺失一段序列,提示US10基因可能与病毒毒力相关,但无试验研究证实。本论文在实验室已有的两株DPV US10缺失株基础上进一步纯化和改建,获得了带绿色荧
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鸭瘟是雁翅目动物中一种常见的传染病,主要感染鸭、鹅等,其病原体为鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）,其高传染性、高致死率的特点对世界各地的养鸭、养鹅业带来了严重的经济损失。全基因组测序分析表明,DPV弱毒株的US10基因较强毒株缺失一段序列,提示US10基因可能与病毒毒力相关,但无试验研究证实。本论文在实验室已有的两株DPV US10缺失株基础上进一步纯化和改建,获得了带绿色荧光报告基因的US10缺失株DPV-EGFP-ΔUS10和无报告基因的US10缺失株DPV-ΔUS10,并对两株缺失病毒的毒力和免疫效果进行了初步评价,结果如下:1.带绿色荧光报告基因和无报告基因的DPV US10缺失株的构建及遗传稳定性对实验室构建保存的DPV US10缺失病毒反复挑斑纯化获得带绿色荧光报告基因的US10缺失病毒DPV-EGFP-ΔUS10;对实验室构建保存的DPV US10缺失病毒DPV-BAC-ΔUS10进行去BAC元件并回补缺失的UL23基因,获得无报告基因的DPV US10缺失病毒DPV-ΔUS10。将两株US10缺失病毒分别在DEF细胞上连续传代25代,在14日龄雏鸭上传代10代,通过PCR和测序鉴定US10缺失情况、病毒毒价变化和对易感动物的致病性变化确定缺失病毒的遗传稳定性。结果:两株US10缺失病毒DPV-EGFP-ΔUS10和DPV-ΔUS10在DEF细胞和鸭体上稳定传代,病毒的US10未发生回复,细胞传代培养的病毒拷贝数和雏鸭传代的肝组织中病毒拷贝数分别稳定在在108.5copies/mL和108copies/g左右;各代次病毒感染鸭均未出现死亡,剖检也均未观察到病理变化。表明缺失病毒在传代过程中稳定、未发生回复突变,对易感动物无致病性未发生变化,即两株US10缺失病毒均具有良好的遗传稳定性。2.DPV US10缺失株对鸭的安全性为了探究US10基因缺失是否对DPV的毒力产生影响及两株DPV US10缺失病毒的安全性,将DPV-EGFP-ΔUS10、DPV-ΔUS10和亲本病毒CHv-50分别以106和107TCID50/只肌肉注射14日龄雏鸭,同时设置空白对照,持续观察10 d。结果:亲本病毒CHv-50组106和107TCID50的鸭子的体温升高至43℃以上并出现死亡,死亡率分别为60%和70%;而2株不同剂量US10缺失病毒组和空白对照组的鸭子体温正常（40.5～42.5℃）,无死亡。表明US10基因缺失可使DPV的毒力下降,两株DPV US10缺失病毒株对鸭无眼观致病现象。3.DPV US10缺失株对鸭的免疫保护效果两株DPV US10缺失病毒DPV-EGFP-ΔUS10、DPV-ΔUS10以同商品化弱毒疫苗1羽份剂量(107.7copies,即105TCID50)分别免疫14日龄雏鸭并设置空白对照,于免疫后14 d采血收集血清检测DPV特异性ELISA抗体和中和抗体的产生情况并用100 LD50DPV强毒攻毒,观察10 d,记录体温、死亡率。结果:两株DPV US10缺失病毒组与商品化弱毒疫苗组一样,鸭血清中检测到DPV特异的ELISA抗体和中和抗体,与空白组间差异显著或极显著;攻毒后空白对照组鸭出现体温升高并全部死亡;而两株DPV US10缺失病毒组同商品化弱毒疫苗组一样,未出现体温升高或死亡。综上:DPV US10基因是与病毒毒力相关的非必需基因;DPV US10缺失株对鸭安全,缺失株可刺激鸭体产生DPV特异性抗体从而对CHv强毒具有良好的攻毒保护效果,具有作为基因缺失疫苗的潜力。
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