研究目的:　　哺乳动物大脑皮层是神经系统中最复杂的结构，包含神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等多种特异性功能的细胞。这些基本的细胞群体之间的交互作用确保大脑皮层对刺激的感受以及兴奋的传导，其中胶质细胞通过形成髓鞘及促进突触等作用协助神经元细胞的功能，在大脑皮层的发育过程中起到重要作用，因此，神经胶质细胞的种类多样性及其功能的研究一直以来是领域内的焦点问题。本论文旨在研究胶质前体细胞的异质性和分化潜能，探讨神经胶质细胞与神经元细胞的关联性，进一步探索不同细胞亚群的潜在分子标记物;另一方面，研究胶质细胞群中关键基因对胶质细胞分化的调控作用，探索神经胶质瘤异质性及与正常胶质细胞的异同性。本研究可以完善神经胶质前体细胞的发育过程，为不同细胞亚群提供分子标记物，同时为神经胶质瘤来源和潜在的分子治疗靶标提供理论依据。　　研究方法:　　1.神经胶质前体细胞的异质性和分化潜能研究　　1.1.PDGFRa-GFP+少突胶质前体细胞的异质性和分化潜能研究　　(1)采用重组酶TryplE消化PDGFRa-GFP新生鼠皮层组织分离单细胞并结合流式细胞术筛选GFP阳性细胞。(2)采用Drop-seq和Fluidigm C1单细胞RNA测序手段采集单细胞的转录组表达水平。(3)通过Seurat和Altanalyze软件对基因转录组及细胞进行聚类分析研究胶质前体细胞的异质性。(4)利用t-SNE降维方法可视化细胞及基因表达水平。(5)采用柱形图显示每组细胞类型中特异性基因表达水平。　　1.2.hGFAP-GFP+星形胶质细胞的异质性和分化潜能研究　　(1)采用重组酶TryplE消化hGFAP-GFP新生鼠皮层组织分离单细胞并结合流式细胞术筛选GFP阳性细胞。(2)采用Drop-seq和Fluidigm C1单细胞RNA测序手段采集单细胞的转录组表达水平。(3)通过Seurat运算程序对基因转录组及细胞进行聚类分析研究胶质前体细胞的分化类型。(4)利用PCA降维方法可视化细胞及基因表达水平。(5)采用小提琴图显示每组细胞类型中特异性基因表达水平。(6)采用免疫荧光技术验证聚类结果并探寻星形胶质细胞全新标记基因。(7)进行Pearson相关性分析探索不同细胞群体间的相关性。　　2.神经胶质细胞的分化驱动因子发掘及与神经胶质瘤发生的关联性研究　　2.1.发掘潜在细胞特异性驱动因子并研究其对胶质细胞分化的调控作用　　(1)开发全新运算程序DRIVE寻找潜在的调控细胞分化方向的驱动因子。(2)选取代表性基因Zfp36l1并构建条件性基因敲除小鼠。(3)原位杂交观察敲除小鼠中Zfp36l1的表达改变。(4)免疫荧光染色观察突变小鼠中少突胶质细胞、星形胶质细胞相关蛋白表达变化。　　2.2.神经胶质瘤的异质性及与胶质细胞异同性的研究　　(1)采用DNP53-PDGFRB逆转录病毒显微注射至小鼠大脑皮层，从而诱导神经胶质瘤发生。(2)分离肿瘤细胞并采用10x Genomics Chromium进行单细胞RNA测序，检测其转录组表达水平。(3)采用Seurat方法对肿瘤细胞基因特征进行聚类分析，研究神经胶质瘤的异质性。(4)对肿瘤细胞基因组进行深入探究，以研究肿瘤特异性细胞群并探索相应特异性表达基因。(5)对比PDGFRa-GFP，hGFAP-GFP和肿瘤细胞数据，确证肿瘤细胞和正常胶质细胞的异同性。(6)采用siRNA、shRNA在神经胶质瘤细胞中对Zfp36l1进行基因沉默，检测肿瘤形成能力。(7)在Control和Zfp36l1c/c小鼠大脑中注射PDGFB-DNP53-Cre病毒，诱导神经胶质瘤产生。　　研究结果:　　1.神经胶质前体细胞的异质性和分化潜能研究　　1.1.PDGFRa-GFP+少突胶质前体细胞的异质性和分化潜能研究　　(1)采用Seurat程序分析1-3天小鼠皮层PDGFRa-GFP+细胞drop-seq基因转录组，t-SNE结果检测到7组不同细胞，分别为内皮细胞、星形胶质细胞、未成熟少突胶质细胞，少突胶质前体细胞、增殖期少突胶质细胞、增殖期成神经细胞以及成神经细胞，其中少突胶质前体细胞占总比例的34.5％。(2)Heatmap结合基因本体论分析显示7组细胞表达各自特异性的基因特征。(3)t-SNE点状图及柱形图显示特异性基因集中表达在对应的每组细胞中并且很少表达于其他细胞。(4)进一步探索文献数据库中的细胞群标记基因在分组细胞中的表达情况，结果提示标记基因均在对应分组中高表达，证实聚类分析结果的可靠性。(5)采用Fluidigm C1平台对新生3天及6天的小鼠进行单细胞测序分析，得到与drop-seq相似的结果。　　1.2.hGFAP-GFP+星形胶质细胞的异质性和分化潜能研究　　(1)采用t-SNE分析5-6天小鼠皮层hGFAP-GFP+细胞Drop-seq基因转录组，结果显示细胞可分为星形胶质细胞、少突胶质前体细胞、放射状胶质细胞、成神经细胞，其中星形胶质细胞占28.1％。(2)Heatmap及基因表达图显示不同细胞群表达相应的特异基因特征。(3)Seurat结果提示潜在的星形胶质细胞标记分子。(4)Pearson相关性分析显示星形胶质细胞与OPC有一定的相关性，而OPC与成神经元细胞有类似性。(5)采用Fluidigm C1平台对hGFAP-GFP新生小鼠大脑皮层进行单细胞测序分析，得到与drop-seq相似的分组结果，以及类似的潜在分子标记物。(6)免疫荧光验证小鼠大脑皮层中hGFAP-GFP阳性细胞与少突胶质前体细胞及神经元细胞标记物共染。(7)免疫荧光显示增殖的hGFAP-GFP阳性细胞中50％为星形胶质细胞，而另一半为增殖的少突胶质前体细胞。(8)免疫荧光染色揭示全新星形胶质细胞的分子标记物Prdm16及Bhlhe40。　　2.神经胶质细胞的分化驱动因子发掘及与神经胶质瘤发生的关联性研究　　2.1.发掘潜在细胞特异性驱动因子并研究其对胶质细胞分化的调控作用　　(1)对不同基因表达和基因之间结合的可能性进行分析研究，得到大量驱动少突胶质前体细胞及星形胶质细胞命运的关键因子。(2)对比少突胶质前体细胞及星形胶质细胞驱动因子，发现有部分基因如Id2，Zfp36l1可以同时驱动两种细胞发育。而Zfp36l1更趋向于驱动少突胶质前体细胞的发育。(3)在胶质细胞中对比Zfp36l1和其他少突胶质前体细胞驱动因子如Olig2、Sox10和Enpp2，星形胶质细胞驱动因子如Rorb、Tcf7l1和Trps1等，结果显示仅Zfp36l1同时高表达于两种胶质细胞中。(4)小提琴图显示Zfp36l1表达于少突胶质前体细胞及星形胶质细胞中，而其同源分子Zfp36l2表达量很低。(5)采用神经干细胞特异重组酶Nestin-cre在小鼠中敲除Zfp36l1，原位杂交显示在大脑皮层中较好的敲除效率。(6)少突胶质细胞标记物Olig2及PDGFRa在Zfp36l1敲除小鼠中明显减少，分别由149±9降为100±5个/mm2，和62±10降为27±5个/mm2。Mbp表达几乎消失表明突变小鼠中髓鞘的缺失。(7)突变小鼠中的星形胶质细胞标记物GS阳性细胞明显增加，从3±1提高至58±3个/mm2，同时GFAP的表达也明显增加。　　2.2.神经胶质瘤的异质性及与胶质细胞异同性的研究　　(1)采用DNP53-PDGFB逆转录病毒在新生小鼠中诱导神经胶质瘤的发生。(2)单细胞测序结果显示神经胶质瘤中主要分子特征包括少突胶质细胞、星形胶质细胞、细胞周期特征、血管内皮细胞及免疫相关细胞群。(3)过滤免疫相关细胞群后，细胞聚类分析显示主要细胞类型为少突胶质前体细胞类似物，同时包括一些星形胶质细胞类似物，并且发现低氧相关以及应激性细胞群。Heatmap及t-SNE点状图表明每组细胞表达特异性基因特征。(4)基因本体论分析表明低氧细胞群高表达低氧相关信号通路。(5)对比低氧/应激细胞群与类OPC细胞群显示特定的差异表达基因。(6)肿瘤中类OPC细胞与正常组织相比具有更多的增殖特性。(7)对比正常脑组织和肿瘤中的OPC系和星形胶质细胞系，结果显示肿瘤中的类胶质细胞与神经胶质瘤的形成有极大关联性。(8)Pearson相关性分析显示肿瘤细胞中的恶性OPC和星形胶质细胞类似物很可能由小鼠胶质细胞发育而来。(9)神经胶质瘤细胞系的增殖，克隆形成能力在沉默Zfp36l1后减弱。(10)Zfp36l1c/c小鼠神经胶质瘤成瘤能力减弱。　　研究结论:　　神经胶质前体细胞在早期发育阶段存在多样性及异质性，少突胶质前体细胞由Olig2+PDGFRa-的早期前体细胞分化而来，星形胶质细胞具有两种类型并发现其潜在的分子标记物，同时神经胶质前体细胞发育过程中展现神经元分子特性。新型运算程序发掘了细胞特异性分化驱动因子，包括可促进少突胶质细胞分化的驱动因子Zfp36l1。神经胶质瘤细胞与正常胶质细胞有相似的分子表达特性，并具有增殖、低氧和应激等独特性质，敲除Zfp36l1可以减弱神经胶质瘤的形成能力。