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一、研究背景脓毒症(sepsis)是外科学和危重病医学中极为常见的一种并发症,肺脏是脓毒症时最易受损的器官之一。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)主要表现为:低氧血症、通气-血流屏障障碍、肺水肿、肺部炎症甚至呼吸困难。促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β等被认为是激活细胞级联反应的主要介质,在急性肺损伤的发生发展中起重要作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是肾素—血管紧张素系统(RAS)的主要活性物质,其作用主要体现在调节血管张力、血流及促进细胞生长、增生等方面。在哺乳动物里,将AngⅡ受体主要分为血管紧张素Ⅱ1(AT1)和2(AT2)型两种受体。目前已知的AngⅡ的生理作用大部分是通过AT1受体介导的。AT1受体的拮抗剂被广泛用于治疗高血压、心血管和肾脏疾病。近年来发现AngⅡ还具有另一重要功能—致炎作用。它可引起血管通透性的增加,诱导调节细胞因子、化学趋化因子和黏附分子等多种炎症介质的产生。新近研究发现,AT1受体拮抗剂能抑制诸如TNF-α、IL-6、IL-8、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、E-选择素等细胞因子和黏附分子,在动脉粥样硬化、风湿性关节炎和肾炎等疾病中具有一定的治疗作用。然而有关AT1受体在急性肺损伤中的作用,尚未见文献报道。本实验的研究目的有二:一是观察AT1受体在内毒素诱导AL1中的作用。二是探讨AT1受体拮抗剂对促炎性细胞因子产生和核因子活化的影响。期望通过上述研究进一步认识急性肺损伤的发生机制,为其防治提供新的思路和方法。二、研究目的1.通过观察AT1受体拮抗剂ZD7155对内毒素诱导ALI小鼠肺组织促炎性细胞因子TNF-α和IL-β产生的影响,了解拮抗AT1受体对急性肺损伤的保护作用。2.观察ZD7155对血管紧张素Ⅱ受体和核转录因子变化的影响,探讨AT1受体在内毒素诱导急性肺损伤中作用的初步机制。三、研究内容第一部分血管紧张素Ⅱ1型受体在内毒素诱导急性肺损伤中的作用24只BABL/C小鼠,随机分为正常对照NS组、LPS组、LPS+ZD7155组,每组8只。用1%戊巴比妥钠60 mg/kg行腹腔注射麻醉,仰卧固定消毒后,颈部正中切口逐层暴露气管,以静脉穿刺针经环甲膜向心端刺入气管,LPS组小鼠将LPS溶液(2mg/kg)在缓慢滴入气管中,拔出穿刺针,将小鼠直立旋转,使药液在肺内分布均匀,缝合切口后观察。正常对照组小鼠进行相同麻醉和穿刺,以等量生理盐水替代LPS。LPS+ZD7155组小鼠在滴注内毒素前30分钟腹腔注射ZD7155(10 mg/kg)。24 h后经心脏取血处死,留取肺脏标本,测定肺脏含水量,作肺脏病理学检查和肺组织TNF-α和IL-1βmRNA检测。第二部分血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂ZD 7155对内毒素诱导急性肺损伤小鼠肺脏核因子活化的影响88只BABL/C小鼠,随机分为正常对照NS组8只、LPS组40只、LPS+ZD7155组40只,各组处理同第一部分实验,LPS和ZD 7155预处理组于致伤后1h、3h、6h、12h、24h等5个时相点经心脏取血处死动物。留取肺脏标本,采用Westernblot法检测肺脏AT1和AT2蛋白的表达,EMSA法检测核因子AP-1和NF-κB活性的改变,并采用免疫组化的方法判断AT1表达。四、研究结果第一部分小鼠气道内滴注2 mg/kg的LPS后24h肺脏含水量较正常生理盐水组明显升高(81.08±1.78%vs 75.83±1.27%,P＜0.01),组织病理学检查显示:肺脏出现明显的病理损害,同时肺脏TNF-α和IL-1βmRNA表达均显著增强(0.65±0.08 vs0.10±0.02,P＜0.01;0.73±0.11 vs 0.09±0.02,P＜0.01),使用ATI受体拮抗剂ZD7155后肺脏含水量明显下降(79.06±2.36%vs 81.08±1.78%,P＜0.05),肺脏的病理损害显著减轻,同时肺脏TNF-α和IL-1βmRNA表达均明显下降(0.29±0.05 vs 0.65±0.08P＜0.05;0.31±0.07 vs 0.73±0.11 P＜0.05)。第二部分正常NS对照组小鼠肺组织中肺泡内吞噬细胞和内皮细胞表达少量的AT1受体蛋白,在LPS致伤1h、3h后肺泡壁细胞和吞噬细胞、多形核白细胞等炎症细胞上表达AT1受体蛋白,LPS致伤6h后,AT1表达于整个内皮细胞床和间质性吞噬细胞。伤后12h、24 h,AT1受体蛋白仍表达于上述肺泡细胞,表达量有所下降。Western blot结果显示,与正常NS对照组相比较,用LPS滴注刺激后6h和24h的肺组织中AT1受体蛋白表达显著升高,其与内参照β-actin表达的相对比值分别为3.44:0.72和2.37:1.26(P均＜0.01)。LPS+ZD7155组AT1蛋白表达显著低于LPS致伤组,其相对比值分别为1.90:3.44和153:2.37(P均＜0.01)。另外,LPS致伤组6h、24h的AT2受体蛋白表达显著低于正常NS对照组,其相对比值分别为0.76:1.31和0.64:1.80(P均＜0.01)。LPS+ZD7155 AT2蛋白表达显著高于LPS组,其相对比值分别为1.09:0.76和1.29:0.64(P均＜0.01)。EMSA结果显示:NF-κB和AP-1的活化分别在LPS刺激后3h和6h达到最高峰。LPS刺激3h、6h后,肺组织细胞核中的NF-κB(52.33±4.8 vs 5.47±0.5,42.78±4.1 vs 5.47±0.5 P＜0.05)和AP-1(61.14±5.7 vs 2.53±0.2,73.25±7.1 vs 2.53±0.2 P＜0.05)活性都显著高于正常NS对照组,预先使用ZD 7155能显著抑制LPS刺激后肺组织的NF-κB活性(20.53±2.4 vs 52.33±4.8,18.51±1.7 vs 42.78±4.1 P＜0.05)和AP-1活性的升高(17.56±1.6vs 61.14±5.7,21.54±2.2 vs 73.25±7.1 P＜0.05)。五、研究结论1.AT1受体介导了肺脏促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生,在内毒素诱导急性肺损伤的发生中起重要的调控作用。2.AngⅡ通过与AT1受体的结合,引起肺脏核因子NF-κB和AP-1的活化和促炎性细胞因子的产生,介导了内毒素诱导的ALI的发生。