错配修复(mismatch repair， MMR)是最重要的DNA修复途径之一，为正常细胞生命活动过程中维持基因组稳定性所必需，该功能的减弱或丧失是导致恶性肿瘤发生的重要原因。因此，对各种细胞在不同生理和病理状况下的DNA MMR功能活性进行监测分析具有重要意义。 美国得州大学健康科学中心孙鲁浙教授团队于2004年在世界上首次提出利用绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因作为报告基因来定量监测活细胞DNA MMR活性的技术模型，并初步证实了其可行性，但由于该模型存在一定量的EGFP本底表达值以及实施过程较为复杂，导致该技术尚未达到完全成熟，使其在实际科学研究应用中的巨大潜力受到限制。构建EGFP异源双链DNA(heteroduplex)分子是该活细胞DNA MMR活性分析技术模型最核心的内容，本课题在原有基础上，围绕这一核心，对EGFP异源双链DNA分子的构建进行了系统的研究。 首先，运用PCR介导的定点诱变技术通过在EGFP基因上引入了一个无义突变(TGG58→TAG)对原有质粒pGEM5z(+)-EGFP和其起始密码子突变型(ATG→ATC)质粒p117进行改造，分别得到了新的突变型EGFP表达质粒p188和p189，经鉴定，新质粒p188与p189在细胞内均无任何EGFP表达，因此，可运用p189与pGEM5z(+)-EGFP构建含有单个碱基错配的EGFP异源双链DNA分子，基于错配修复引起无义突变消除而恢复EGFP表达来监测活细胞DNAMMR活性。 然后，在第一部分获得正常EGFP表达质粒p111和突变型EGFP表达质粒p189的基础上，对如何高效制备EGFP异源双链DNA分子进行了深入研究。单链DNA的获取是构建异源双链DNA分子的关键环节，为优化这一关键点，我们改良了传统的噬菌体单链制备方法，建立了一种“噬菌粒高纯ssDNA快速制备法”；同时，还提出了一种基于缺刻酶的“质粒ssDNA体外制备法”，该方法可广泛适用于普通质粒，具有推广意义。在解决了ssDNA的制备问题后，我们将所获取的p111的编码股高纯ssDNA与BstXI线性化的p189退火，对产物运用一种基于plasmid-safe ATP dependent DNase的新型纯化方法处理，高效的制备了优质EGFP异源dsDNA。将获得的EGFP异源dsDNA导入到一株DNA MMR功能正常的细胞株-Hela和一株DNA MMR功能丧失的细胞株-HCT116，对EGFP表达情况运用荧光显微镜观察和流式细胞仪分析，结果显示其能明显区分两株细胞，初步展示了这种EGFP异源dsDNA对于活细胞DNA MMR活性分析的价值。 最后，综合对质粒运用基于无义突变策略的定点诱变技术和质粒ssDNA体外制备技术，以及基于PSAD的纯化方法，我们提出了一种运用质粒构建单碱基或多碱基错配等异源dsDNA分子的新模式，该模式适用于普遍的质粒和目的基因，这对于促进包括DNA MMR在内的各类DNA修复功能机制研究具有重要科学意义。