第一部分 CLN8P相互作用蛋白质的筛选 目的 CLN8是神经元蜡样脂褐质沉积症(the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)这一疾病群中的一个致病基因。关于其功能知之甚少。我们采用酵母双杂交技术。筛选人胎脑cDNA文库表达产物中与CLN8P相互作用的分子,初步探讨CLN8P的功能,为其在发病机制中的作用提供新线索。 方法 将CLN8构建到酵母双杂交系统中的pLexA载体,检测该重组质粒对报告基因LacZ的自激活作用。通过酵母双杂交方法,从人胎脑cDNA文库表达产物中筛选与CLN8P相互作用的分子,提取阳性克隆质粒DNA,进行测序及生物信息学分析。 结果 成功构建酵母双杂交系统plexA-CLN8诱饵质粒,诱饵质粒对报告基因LacZ无自激活作用,筛选到41个阳性克隆。序列测定表明,其中有一个阳性克隆编码人NADH脱氢酶亚单位5。 结论 1、CLN8P与ND5在酵母细胞中有相互作用。 2、ND5与CLN8P结合,可能是造成脂褐质线粒体ATP合酶亚基C积聚的新机制之一。 第二部分 CLN8基因真核表达载体构建及检测 目的 构建真核表达载体,为在哺乳动物细胞内验证CLN8与ND5是否存在相互作用奠定实验基础。 方法 采用PCR技术扩增CLN8基因,将其亚克隆到P-Flag真核表达载体,在HeLa细胞中表达,对表达产物进行Western blot鉴定。 结果 特异扩增CLN8基因编码序列,构建了真核表达载体P-Flag-CLN8,在HeLa