狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)隶属于弹状病毒科(Rhabdovidae family)基因1型狂犬病病毒属成员病毒(Lyssavirus),是人和动物狂犬病的病原体。如今世界范围内狂犬病病毒属的成员主要有七个基因型：基因1型(狂犬病病毒,RABV),基因2型(Lagos蝙蝠病毒,LBV),基因3型(Mokola病毒,MOKV),基因4型(Duvenhage病毒,DUVV),基因5型(欧洲蝙蝠1型狂犬病病毒,EBLV-1),基因6型(欧洲蝙蝠2型狂犬病病毒,EBLV-2),基因7型(澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒,ABLV)。其中基因1型狂犬病病毒RABV对人和动物带来的危害最严重。其病毒结构蛋白磷蛋白(P)作为一种多功能的非蛋白激酶蛋白,能够参与病毒的转录与复制,也是狂犬病病毒的一种干扰素拮抗因子。迄今为止,虽有诸多研究表明P蛋白既能与RABV本身的病毒结构蛋白又能与宿主细胞蛋白互作并参与RABV的感染,但这方面的数据还是相当有限,该病毒的致病机制还远未明了。本研究阐明了细胞周期蛋白37 (Cdc37)依赖和非依赖热休克蛋白90 (Hsp90)结合的途径稳定P蛋白促进RABV感染的分子机制,旨在为将来抗RABV新药物靶标的研究开发提供可供参考的基础数据。1.P蛋白作为Hsp90客户蛋白的发现前期研究发现RABV感染过程中Hsp90能够被募集至病毒转录与复制场所内基氏小体(Negri bodies, NBs)中,提示Hsp90可能涉及RABV的感染。因此本研究以鼠神经瘤母细胞N2a为RABV感染模型,以基因1型疫苗毒株HEP-Flury为主要实验毒株,首先采用Hsp90特异性抑制剂分析其对RABV感染的影响。Hsp90抑制剂格尔德霉素(GA)及其衍生物烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)的处理能够降低细胞内RABV病毒蛋白的累积水平、病毒的复制水平、病毒各基因的转录水平以及病毒的滴度。Hsp90抑制剂17-AAG的处理并不能影响蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)对RABV N蛋白基因mRNA水平的抑制作用。由此提示,Hsp90影响RABV感染可能是通过影响病毒蛋白稳定性引发,而不是由其直接影响病毒基因的转录或mRNA的稳定性导致。然而Hsp90通过何种途径影响病毒蛋白稳定性?是否是通过蛋白酶体途径和自噬途径?为了验证这个假设,本研究通过免疫印迹实验发现,蛋白酶体抑制剂MG-132的处理未能抑制17-AAG对RABV病毒蛋白N和P的降解作用,而自噬阻断剂wortmannin的处理可阻断17-AAG对RABV病毒蛋白N和P的降解作用。由此提示,Hsp90抑制剂降解RABV病毒蛋白N和P可能是通过自噬途径进行。为了确证Hsp90抑制剂降解RABV病毒蛋白的自噬途径以及避免wortmannin药物的脱靶效应,借助RNAi敲降试验证明自噬途径关键成分LC3B的敲降同样可阻断17-AAG对RABV病毒蛋白N和P的降解作用。由此表明Hsp90抑制剂可引起RABV病毒蛋白N和/或P的自噬途径降解。由此同时,本研究构建了pSG5-N和pSG5-P两个携带SV40启动子的真核表达载体,证明了17-AAG能够特异降解真核表达的P蛋白,而对真核表达N蛋白没有影响。进一步的免疫共沉淀实验(Co-IP)结果表明,RABV天然性或外源性表达的P蛋白可与内源性或外源性表达的Hsp90互作。此外,Co-IP实验结果又发现狂犬病病毒属成员CVS-11、ABLV和MOKV三个毒株的P蛋白均能够与Hsp90发生结合。Hsp90与P蛋白的互作是所有狂犬病病毒属成员毒株共有的特性。由此表明,狂犬病病毒属成员毒株P蛋白是Hsp90的客户蛋白。2.Cdc37参与Hsp90-P复合物形成的发现Hsp90对其客户蛋白伴侣功能的发挥需要一大批辅助伴侣蛋白的支持。为了找寻参与Hsp90-P复合物形成的关键辅助伴侣蛋白,我们首先分析了Hsp90变构体抑制剂Celastrol对RABV病毒蛋白累积的影响。免疫印迹实验结果表明,Celastrol药物具有类似17-AAG药物的作用也能够降低RABV P蛋白累积水平。由此提示辅助伴侣蛋白Cdc37可能参与了Hsp90-P复合物的形成。接着共聚焦实验显示,RABV感染情况下含有P蛋白的NBs能够大量募集Cdc37; Co-IP实验结果进一步显示Hsp90-Cdc37-P三元复合物的形成。由此表明,P蛋白是Hsp90/Cdc37伴侣系统的客户蛋白。3.Cdc37募集P蛋白至Hsp90系统依赖和非依赖Hsp90结合途径的发现已有研究报道Cdc37募集蛋白激酶至Hsp90系统存在依赖和非依赖Hsp90结合的途径。而Cdc37对其他种类客户蛋白的募集途径不甚明了。那作为非蛋白激酶的RABVP蛋白,Cdc37对其募集至Hsp90系统是否也存在这两条途径或其他途径?在本研究中我们证明Cdc37参与Hsp90-P复合物形成的四条途径：缺失Hsp90结合区域的Cdc37截短体未能提升P蛋白的累积水平,而野生型Cdc37和Cdc37截短体Cdc37(aa 1-323)能够通过依赖Hsp90结合的途径募集P蛋白至Hsp90系统进而促进P蛋白的累积；破坏了与Hsp90结合能力的Cdc37M165和L206单点和双点突变体依然保持着与P蛋白的互作,并提升P蛋白的累积水平,而且能够模拟野生型Cdc37增强Hsp90-P之间的互作,由此指示野生型Cdc37还能够以一种非依赖Hsp90结合的方式募集P蛋白至Hsp90系统来保护P蛋白的稳定性：Cdc37的激活需要其Ser13位点的磷酸化修饰,非激活的Cdc37(将Cdc37 Ser13位点突变成Ala)并未减弱其与Hsp90和P蛋白的互作,而且能够募集P蛋白至Hsp90系统进而促进P蛋白的累积,由此指示非激活的Cdc37存在类似于野生型Cdc37依赖Hsp90结合的方式募集P蛋白至Hsp90系统进而对P蛋白进行稳定；破坏了与Hsp90结合能力的非激活Cdc37 M165和L206的单点和双点突变体也依然保持着与P蛋白的互作,并提升P蛋白的累积水平,而且能够模拟野生型Cdc37增强Hsp90-P之间的互作,由此指示非激活的Cdc37也能够以一种非依赖Hsp90结合的方式募集P蛋白至Hsp90系统来保护P蛋白的稳定性。4. Cdc37、Hsp90稳定P蛋白正调控RABV感染的发现首先免疫印迹实验结果显示RABV的感染能够诱导Cdc37和Hsp90蛋白的表达,由此提示Cdc37和Hsp90在RABV感染过程中可能起着正向调控作用。接着,采用真核过表达的方式研究Cdc37和Hsp90对RABV感染的影响,结果发现,过表达Hsp90和Cdc37能够从蛋白水平引起RABV病毒P蛋白的累积。然后我们通过免疫印迹实验发现,过表达Cdc37和Hsp90能够阻断蛋白合成抑制剂CHX处理情况下的P蛋白降解,而对CHX处理情况下的N蛋白的降解无影响,由此表明Cdc37和Hsp90是从蛋白稳定性水平而不是从蛋白合成水平影响RABV病毒P蛋白的累积。此外,采用RNAi干扰的方法降低Cdc37或Hsp90蛋白的表达能够显著降低病毒蛋白表达和病毒RNA合成的水平,并减少细胞内病毒粒子的释放量,由此证实了Cdc37和Hsp90在RABV感染的正向调控作用。最后,综上数据,Cdc37和Hsp90是通过稳定P蛋白促进P蛋白的累积进而影响RABV的感染。