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第一部分MALAT1和PFKFB3在早发型子痫前期患者胎盘中的表达和定位研究目的检测MALAT1和PFKFB3在人胎盘组织中的表达和定位,同时比较MALAT1和PFKFB3在早发型子痫前期患者和正常妊娠者中的表达差异。研究方法1.实验分组:根据实验设计分为早发型子痫前期组和正常对照组;收集两组纳入孕妇的晚孕期胎盘组织。2.使用q RT-PCR和（或）Western Blot方法检测两组纳入孕妇胎盘组织中的MALAT1和PFKFB3表达。3.使用荧光原位杂交（FISH）检测MALAT1在胎盘组织中的表达定位和采用免疫组化（IHC）了解PFKFB3在胎盘组织中的表达定位。研究结果1.与正常胎盘组织相比,早发型子痫前期患者胎盘组织中的MALAT1的m RNA水平和PFKFB3的m RNA和蛋白水平显著降低。2.MALAT1和PFKFB3在早发型子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织中均主要定位于细胞质。研究结论MALAT1和PFKFB3在早发型子痫前期胎盘组织中较正常胎盘组织表达显著下降,提示MALAT1和PFKFB3参与早发型子痫前期发病。第二部分PFKFB3调节糖酵解活性和内皮细胞功能研究目的探讨PFKFB3对糖酵解活性和内皮细胞功能的影响。研究方法1.上调PFKFB3的表达:PFKFB3过表达组（转染PFKFB3过表达质粒至内皮细胞）,同时设立阴性对照组（转染vector）;采用q RT-PCR和Western Blot检测转染效率。2.下调PFKFB3的表达:PFKFB3敲除组（转染PFKFB3的si RNA至内皮细胞）,同时设立阴性对照组（转染si-NC）;采用q RT-PCR和Western Blot检测转染效率。3.检测过表达/敲除PFKFB3后内皮细胞糖酵解活性的变化:用相应试剂盒检测细胞内ATP、NADPH、活性氧（ROS）和细胞外乳酸的产生水平。4.检测过表达/敲除PFKFB3对内皮细胞功能的影响:采用CCK-8、流式细胞仪、Transwell、小管形成和细胞骨架染色实验研究PFKFB3对内皮细胞增殖、细胞周期进程、迁移、小管形成、丝状伪足和板状伪足形成的影响。研究结果1.PFKFB3过表达组内皮细胞中PFKFB3表达明显升高。2.PFKFB3敲除组内皮细胞中PFKFB3表达明显降低,其中si RNA-3表现出最佳的PFKFB3敲低效果,并用于后续实验。3.PFKFB3的过表达增加了细胞内ATP、NADPH和细胞外乳酸的表达,同时减少了细胞内ROS的表达,而PFKFB3的沉默产生了完全相反的效果。4.PFKFB3的过表达促进了内皮细胞增殖、细胞周期进程、迁移、小管形成、丝状伪足和板状伪足形成,而PFKFB3的沉默产生了相反的效果。研究结论PFKFB3的过表达增加了糖酵解活性以及内皮细胞的增殖,迁移和小管形成能力。PFKFB3通过加速细胞周期促进内皮细胞增殖,并通过促进细胞突起的形成提高内皮细胞的运动能力。PFKFB3的沉默产生了相反的效果。第三部分MALAT1作为mi R-26a和mi R-26b的ce RNA调节内皮细胞中PFKFB3的表达研究目的阐明MALAT1作为mi R-26a和mi R-26b的ce RNA调节内皮细胞中PFKFB3的表达。研究方法1.下调MALAT1的表达:MALAT1敲除组（转染MALAT1的敲除质粒至内皮细胞）,同时设立阴性对照组（转染sh-NC）;采用q RT-PCR和（或）Western Blot检测转染效率和mi R-26a/26b、PFKFB3表达。2.上调mi R-26a/26b的表达:mi R-26a/26b过表达组（转染mi R-26a/26b过表达质粒至内皮细胞）,同时设立阴性对照组（转染mimic-NC）;采用q RT-PCR和Western Blot检测转染效率和PFKFB3表达。3.采用RNA hybrid软件预测结合位点,进一步用双荧光素酶实验和RNA下拉实验验证MALAT1和mi R-26a/26b在内皮细胞中的相互作用。4.采用RNA hybrid软件预测结合位点,进一步用双荧光素酶实验验证PFKFB3和mi R-26a/26b在内皮细胞中的相互作用。5.将MALAT1敲除质粒和mi R-26a/26b敲除质粒共同转染到内皮细胞中,采用q RT-PCR和Western Blot检测PFKFB3的表达。研究结果1.sh RNA-5277显示出最佳的MALAT1敲除效果,并在随后的实验中使用。内皮细胞中MALAT1敲除显著下调PFKFB3在m RNA和蛋白质水平的表达,同时上调mi R-26a/26b m RNA水平。2.mi R-26a/26b过表达组内皮细胞中mi R-26a/26b表达明显升高,PFKFB3的m RNA和蛋白质水平明显降低。3.mi R-26a/26b模拟物降低了野生型而不是突变型MALAT1的荧光素酶活性,且正义MALAT1使mi R-26a/26b表达下调,表明mi R-26a/26b直接与MALAT1结合。4.mi R-26a/26b模拟物降低了野生型而不是突变型PFKFB3的荧光素酶活性,表明mi R-26a/26b直接与PFKFB3结合。5.在敲除MALAT1的细胞中下调mi R-26a/26b的表达可逆转PFKFB3 m RNA和蛋白质表达的降低。研究结论在内皮细胞中,MALAT1可以作为mi R-26a/26b的海绵调节PFKFB3的表达。第四部分MALAT1通过PFKFB3调节糖酵解活性和内皮细胞功能研究目的明确MALAT1通过PFKFB3调节糖酵解活性和对内皮细胞功能的影响。研究方法1.细胞实验分组:sh-NC:阴性对照组。sh-MALAT1:转染MALAT1敲除质粒至内皮细胞。sh-NC+PFKFB3 plasmid:将阴性对照与PFKFB3过表达质粒共转染至内皮细胞。sh-MALAT1+PFKFB3 plasmid:将MALAT1敲除质粒与PFKFB3过表达质粒共转染至内皮细胞。2.采用q RT-PCR和（或）Western Blot检测转染效率。3.检测转染后内皮细胞中糖酵解活性变化:用相应试剂盒检测细胞内ATP、NADPH、活性氧（ROS）和细胞外乳酸的产生水平。4.检测转染后对内皮细胞功能的影响:采用CCK-8、流式细胞仪、Transwell、小管形成和细胞骨架染色实验研究转染后对内皮细胞增殖、细胞周期进程、迁移、小管形成、丝状伪足和板状伪足形成的影响。研究结果1.将细胞分为4组,分别转染sh-NC、sh-MALAT1、sh-NC+PFKFB3 plasmid或shMALAT1+PFKFB3 plasmid质粒,可有效上调或下调MALAT1和PFKFB3的表达。2.敲除MALAT1显著降低了细胞ATP、NADPH和细胞外乳酸水平,但增加了细胞内ROS水平,而在MALAT1沉默的内皮细胞中同时过表达PFKFB3逆转了这些效应。3.PFKFB3的过表达逆转了MALAT1敲除诱导的对内皮细胞增殖、细胞周期进程、迁移、小管形成、丝状伪足和板状伪足形成的抑制作用。研究结论敲除MALAT1可降低糖酵解活性,并通过下调糖酵解限速酶PFKFB3抑制内皮细胞的血管生成,而过表达PFKFB3可以逆转这些变化。