穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类具特殊功能的多肽分子,一般由30个以下的氨基酸残基构成,具有生物膜穿透功能,还可携带其它分子甚至超分子颗粒进入细胞中。正是因为这种特殊的功能,它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具,具有广泛的应用前景。　　其中,TAT是最先被发现并证实的具穿膜功能的多肽分子。大量的实验研究表明,TAT是一类细胞毒性较低但运输能力较强的活性多肽。　　为了确认TAT具有的穿膜和携带生物大分子能力,我们引入了绿色荧光蛋白(GFP)作为标记因子,使tat-gfp基因串联于原核表达载体pET28a,在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行IPTG诱导表达。利用蛋白带有的His标签进行Ni-NTA亲和层析柱纯化,得到了融合蛋白TAT-GFP。然后我们利用得到的蛋白分别进行了体外试验和体内实验。通过在激光共聚焦显微镜下直接观察与BHK-21细胞孵育一定时间后的细胞中GFP的自发荧光,考察了TAT携带GFP在体外培养细胞中的穿膜特性及细胞定位,证明其可迅速穿透细胞膜而广泛分布于细胞的各个部分,尤其是细胞核中;对照组的GFP则无穿膜功能。体内实验表明,在通过尾静脉注射给药2h后,即可在小鼠的各个主要器官和组织中观察到明显的荧光出现,表明融合表达的TAT在活体内也具有广泛的穿膜活性。　　在以上TAT功能研究基础上,我们对其应用进行了初步的探索,这一工作主要着眼于真核细胞的保护方面。目前细胞的保护主要通过细胞保护剂和低温来实现,但现有的很多保护剂对细胞有伤害或难以达到理想的效果。海藻糖是近年研究最为广泛的细胞保护剂之一,它对细胞基本无害且保护效果显著,但在应用上一个主要的问题是,细胞内海藻糖很难达到足够的浓度以发挥功效。我们期望通过TAT的应用为解决这一难题提供新的思路。　　首先,我们通过PCR技术获得了E.coli DH5α菌株的海藻糖合成酶基因-6-磷酸海藻糖合成酶基因(otsA)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因(otsB),并将二者分别与tat基因实现串联、融合表达。利用纯化的蛋白进行体外酶催化反应,HPLC检测初步证实了两融合蛋白在体外可催化底物形成海藻糖,具有一定的酶催化活性。由此提示,通过TAT增加细胞内海藻糖合成酶的含量有可能提高海藻糖浓度,从而增加细胞抗性。　　总之,通过原核表达我们获得了融合形式的TAT-GFP蛋白,利用此蛋白证明TAT在体内和体外都具有穿膜活性;通过TAT短肽所进行的细胞保护方面的初步探索,为提高细胞内海藻糖负载提供了新的思路。