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研究背景糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)作为一种糖尿病并发症,是指在没有高血压和冠状动脉等相关心血管疾病的情况下,心脏的结构和功能受到损伤的一种疾病,主要表现为心脏扩大、心肌舒张及收缩功能下降,其中心肌纤维化是糖尿病心肌病心肌损伤中主要的病理变化之一。近年来有研究表明,Hippo通路中重要的效应分子Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)与心血管疾病的病理过程密切相关。但目前有关于糖尿病心肌病研究中,YAP对心肌损伤的作用及意义尚不十分清楚。有研究表明YAP可以促进结缔组织生长因子(CTGF)及纤连蛋白(Fibronectin)蛋白的表达,从而影响纤维化的进程。探究YAP对糖尿病心肌病心肌损伤的作用及影响,可能为糖尿病心肌病的治疗提供新的思路及靶点。研究目的1、构建糖尿病心肌病大鼠模型,检测在糖尿病大鼠心肌中YAP表达量的变化,以及糖尿病心肌病大鼠心肌病理变化;2、构建靶向YAP的基因沉默慢病毒载体,观察下调YAP的表达对糖尿病心肌病大鼠一般情况、心肌纤维化及心功能的影响;3、检测不同时间梯度的高糖刺激下原代心肌成纤维细胞中YAP表达量及相关纤维化指标表达的变化,探讨YAP对糖尿病心肌病心肌损伤及心功能影响的机制。研究方法1、慢病毒包被的YAP小干扰RNA的构建:根据相关文献查询大鼠的YAP小干扰基因序列,委托上海吉凯公司构建慢病毒(lentivirus)包被的YAP小干扰RNA(LV-YAP-shRNA)片段用于靶向沉默YAP基因表达,同时构建空白对照LV-scrambled-shRNA 用于对照试验。2、动物模型建立:实验选取60只体重范围在200g左右的健康雄性Wistar大鼠进行实验。所有大鼠于实验室环境适应性喂养1周后投入实验,将大鼠随机分为糖尿病组(模型组,45只),对照组(control组,15只)。糖尿病组大鼠首先使用柠檬酸缓冲液稀释的链脲佐菌素(65mg/kg)单次大剂量腹腔注射建立糖尿病模型,造模1周后检测血糖值大于>11.1 mmol/L且伴有多饮多食多尿症状的大鼠视为造模成功。糖尿病大鼠模型建立12周后行超声心动图检查,显示心腔扩大及收缩功能降低的糖尿病大鼠视作糖尿病心肌病模型成功,随后将糖尿病模型组大鼠分为糖尿病心肌病组(DCM组,15只)、YAP小干扰RNA组(LV-YAP-shRNA 组,15 只)及小干扰 RNA 阴性对照组(LV-scrambled-shRNA,LV-SC-RNA 组,15 只)。LV-YAP-shRNA组、LV-SC-RNA 组大鼠分别经尾静脉注射慢病毒 LV-YAP-shRNA 和 LV-scrambled-shRNA(1 ×106PFU/只)。病毒注射2周后每组随机抽取3只检测病毒转染效率。喂养4周后麻醉行超声检测并处死取材。3、心功能检测:慢病毒注射4周后对所有大鼠进行心功能检测。大鼠进行麻醉后,使用VEVO770成像系统评估大鼠心功能。4、大鼠一般情况测量:所有大鼠进行血糖、体重、心脏重量以及血压的测量。5、免疫组织化学染色:4.5μm厚的心肌组织常规病理切片用于进行免疫组织化学染色实验,评估心肌组织胶原Ⅰ型(Collagen Ⅰ)、胶原Ⅲ型(Collagen Ⅲ)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白(Fibronectin)、纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)等蛋白的表达情况。6、Masson三色染色法评估大鼠心肌组织间质胶原沉积情况。7、常规HE染色评估心肌细胞损伤及心肌结构改变。8、大鼠乳鼠原代心肌成纤维细胞的提取及培养:在无菌操作台内将出生1-3天的Wistar大鼠乳鼠的心脏提取出来后剪成肉糜,随之消化成单细胞悬液,而后差速培养将心肌成纤维细胞与心肌细胞分离,并培养心肌成纤维细胞用于后续细胞实验。9、心肌成纤维细胞的后续实验:心肌成纤维细胞分别转染LV-YAP-shRNA,LV-SC-shRNA,后分别在正常或高糖状态下培养48h。10、免疫印迹法(Western blot):Western blot用于检测大鼠心肌组织和成纤维细胞总蛋白中YAP及纤维化相关指标的表达情况。11、实时荧光定量PCR(Real-time PCR):提取心肌组织及心肌成纤维细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测YAP、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、PAI-1的mRNA表达水平。12、蛋白质免疫共沉淀(Co-IP):检测原代心肌成纤维细胞中YAP蛋白与TEAD的结合。13、染色质免疫共沉淀(Ch-IP):检测YAP蛋白与结缔组织生长因子(CTGF)的相互关系。14、统计学分析:实验数据以平均数±标准差表示,实验数据均由GraphPad 7.0软件处理分析,组间差异利用单因素方差分析进行比较。P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果1、在糖尿病心肌病大鼠中YAP表达水平明显增高,YAP基因沉默能够下调糖尿病心肌病大鼠中YAP的表达。2、在糖尿病心肌病大鼠中心功能下降且心肌纤维化明显加重,YAP基因沉默能够改善糖尿病心肌病大鼠的心肌纤维化及心功能。3、大鼠原代成纤维细胞在高糖刺激下YAP表达水平明显增加,而YAP基因沉默能够下调相关纤维化指标的表达。4、YAP能通过与TEAD结合,在染色质水平影响CTGF来参与糖尿病心肌病的病理损伤过程。结论及意义在高糖的刺激下,糖尿病心肌病大鼠心肌中YAP的表达量升高。YAP的表达升高参与损伤了糖尿病心肌病大鼠的心功能,加重了糖尿病心肌病大鼠的心肌纤维化。YAP基因沉默不仅有效降低了糖尿病心肌病大鼠中YAP的表达,而且降低了糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化程度,并改善了糖尿病心肌病大鼠的心功能。这可能与YAP通过与TEAD结合进而调控CTGF的基因表达有关。这一发现为糖尿病心肌病的治疗提供了新的思路。