小分子荧光探针是指在特定体系或环境中,其荧光信号会跟随某一物质性质的改变而做出相应变化的分子。相较于其他分析工具,小分子荧光探针成本低廉,操作简便,特异性高,检测限低,方便对目标进行可视化检测或跟踪,已日益成为研究生物系统的有力工具。近十年来,利用近红外(NIR)光子作为激发光源的双光子显微技术(TPM)已成为生物医学研究中一种新的而又必不可少的成像工具。由于TPM使用的是具有聚焦激发能力的近红外光,所以与相应的单光子显微成像(OPM)相比,其对组织造成的光损伤和光漂白更少,具有组织深处成像能力强、空间分辨率高、可长时间观测等优点。双光子荧光探针已经成为一种极其重要的工具用以检测生命微环境,近年来蓬勃发展。氰化物毒性极大,在广泛的工业应用中造成了持续性的环境问题,成为威胁人们健康的极大隐患,这使得人们对氰化物检测方法的发展进行了大量的研究。以往用于氰化物分析的方法往往需要复杂而又耗时的程序,需要使用具有高检测限的精密仪器。而用于检测氰化物的化学探针,由于对其颜色或荧光强度(或发射波长)的变化的监测简单、便捷、成本低廉并可以快速实现,从而使得人们在过去十年中对其进行了积极的研究与开发。二氧化硫(SO2)是大气污染的主要因素之一,长期接触SO2会引起一些呼吸道反应,严重的甚至会导致肺癌、心血管疾病和神经疾病,包括偏头痛、中风和脑癌。吸入的SO2通常会被水合,在呼吸道中产生亚硫酸,随后形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐的衍生物。亚硫酸钠是一种常见的食品原料,可以保护食物和饮料使其免受氧化;然而,过量的亚硫酸盐可能会引起哮喘和其他过敏反应。SO2及其衍生物在我们的生活中无处不在,然而我们对它们的生物学作用却知之甚少,因为SO2及其衍生物无法在体内直接检测到。高效液相色谱(HPLC)是用于测定生物样品中亚硫酸盐/亚硫酸氢盐的最常用的方法,但需要复杂和有创的样品处理,不适合实时和持久的检测生物体中的亚硫酸盐/亚硫酸氢盐。因此,需要开发一种快速,便捷且可靠的实时检测生物体中亚硫酸盐/亚硫酸氢盐水平的方法。粘度是与扩散控制过程相关的关键因素之一,在生物活动以及在生命科学、化学和其他领域中起着至关重要的作用,特别是在生物系统中,生物和细胞水平的各种生物活动都与粘度息息相关。此外,在亚细胞器水平上,线粒体基质中的粘度与线粒体呼吸状态密切相关,通过机械或渗透诱导线粒体网络组织发生变化,对三磷酸腺苷(ATP)循环产生很大影响。表明线粒体代谢的调节可以通过线粒体基质粘度的变化,进而调节代谢物的扩散。本文通过阅读和调研大量文献,借鉴本课题组工作并以此为基础,设计合成了可以分别检测CN-及粘度的双光子探针L1、L2和一种可以对及粘度进行双检测的比率型双光子荧光探针MBCB。1.设计了具有二维ICT体系的咔唑基衍生物L1、L2。HSO3-以咔唑基团为给体,在两端分别引入支链作为受体单元,我们研制了两种新型化学探针L1和L2,分别用于氰化物和粘度的测定。引入硝基苯肼,通过CN-对-NH-的去质子化效应使得氮原子上的电子云密度增加,导致了整个体系中分子内电荷转移(ICT)的变化,使得我们可以通过比色法检测CN-。基于2,4-二硝基苯腙的探针L1对CN-的检测具有较高的选择性和灵敏度,肉眼可观察到测试溶液从黄色到紫色的颜色变化,紫外最大吸收波长从440 nm红移到500 nm。双光子荧光探针L2作为分子转子,在给电子的咔唑基与吸电子的阳离子毗啶盐之间形成ICT状态,可用对粘度有“turn on”型的荧光响应,粘度的对数与单/双光子荧光强度的对数之间均存在良好的线性关系。此外,细胞的双光子共聚焦荧光成像实验表明L2具有良好的细胞膜透性,可用于对细胞粘度的监测和成像。2.设计合成了一种可以通过不同荧光信号分别检测HSO3-和粘度的比率型双光子荧光探针MBCB。向咔唑母体框架上引入苯并噻唑基团,给电子的咔唑与吸电子的苯并噻唑盐形成D-π-A结构。化合物通过迈克尔加成机理可与HSO3-发生反应,具有较高的选择性,在365 nm紫外灯照射下可肉眼观察到加入HSO3-前后测试溶液从桃红色到紫色的荧光颜色变化。MBCB对HSO3-的检测灵敏度极高,检测限低达0.81 nM。而化合物的咔唑基团与甲基苯并噻唑盐之间通过双键连接,可以作为分子转子用于对粘度的检测。MBCB对于HSO3-和粘度都可以通过比率计量的方法进行定量检测。MBCB具有良好的双光子性能及优秀的生物相容性,在小鼠肝脏切片中的荧光穿透深达130μm。细胞及斑马鱼成像实验表明MBCB专一靶向线粒体,在双光子激发下可以有效对细胞线粒体及活体斑马鱼中的HSO3-进行可视化的检测。MBCB作为检测粘度的比率型双光子荧光探针,可以定量的检测溶液或细胞中的粘度。通过荧光寿命成像,MBCB可以用来定量分析细胞中的粘度分布。药物诱导线粒体凋亡成像实验说明探针MBCB可以检测细胞凋亡前后线粒体粘度的变化,并可通过检测线粒体粘度的变化来判断细胞是否凋亡,也为研究细胞凋亡提供了一种新方向。