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研究背景脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种致残性疾病。轴突脱髓鞘是SCI的主要病理特征之一,促进再髓鞘化是修复SCI新的突破点。少突胶质细胞是脊髓中构成髓鞘和再髓鞘化的主要细胞,促进少突胶质细胞分化对髓鞘再生具有重要意义。SCI常伴有炎症反应,脊髓中星形胶质细胞可以在炎症作用下,重新获得干细胞的特性即发生去分化,从而为再生医学的相关研究提供一个很有希望的细胞来源。将具有干细胞潜能的星形胶质细胞转化为少突胶质细胞是SCI修复的一种创新策略。然而,星形胶质细胞发生去分化的机制仍然不明确,并且如何将星形胶质细胞转化为少突胶质细胞,并参与SCI之后再髓鞘化修复的探索仍留有很大的空白。Nanog是维持干细胞特性所必需的转录因子,Nanog是否参与星形胶质细胞去分化过程尚不清楚。对星形胶质细胞去分化的深入了解,为SCI的修复提供了大量潜在的细胞资源并奠定了理论基础。SCI之后的再髓鞘化修复也需要少突胶质细胞的有效分化。Neuregulin-1（Nrg1）在少突胶质细胞分化中起重要的促进作用。因此,使用Nrg1驱动去分化的星形胶质细胞向少突胶质细胞方向分化,是治疗SCI脱髓鞘的一种具有重大开发潜力的治疗策略。研究目的探讨Nanog在星形胶质细胞去分化中的作用及其可能的机制;探讨Nrg1诱导去分化星形胶质细胞转化为少突胶质细胞参与SCI之后再髓鞘化修复的可能性及其可能的机制。研究方法本研究利用肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor-a,TNF-a）模拟体内的炎症反应,并用于刺激原代大鼠脊髓星形胶质细胞去分化为反应性状态,以探究其中可能的机制。同时在体内外用Nrg1诱导去分化的星形胶质细胞,以诱导少突胶质细胞分化和SCI之后的再髓鞘化。利用q RT-PCR和Western blotting检测Nanog的表达,用q RT-PCR和免疫荧光检测未成熟标志物CD44和Musashi-1以及少突胶质细胞标志物PDGFR-α和O4的表达。利用Western blotting检测了NF-kB和PI3K-AKT-m TOR信号通路中关键蛋白分子包括Akt,p-Akt,m TOR,p-m TOR,IKK,p-IKK,NF-kB p65,p-NF-kB p65,IkBα,p-IkBα和PI3K的表达。为了进一步探讨Nanog在星形胶质细胞去分化中的作用,用Nanog的小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）下调Nanog的表达。为了进行功能回复实验,分别利用通路抑制剂BAY11-7082抑制NF-kB信号通路,Erb B抑制剂抑制Nrg1的作用。利用LFB髓鞘染色和对髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）含量的检测反应髓鞘的再生和保护。利用Western blotting和免疫组织化学方法检测髓鞘标志蛋白MBP,轴突标志蛋白NF-H和胶质增生标志蛋白胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达。利用BBB评分系统评估大鼠运动功能恢复。研究结果结果表明TNF-a可促进星形胶质细胞重新表达未成熟标志物CD44和Musashi-1,提示TNF-a诱导了星形胶质细胞发生去分化为干细胞状态。此外,由于TNF-a是激活NF-kB信号通路的经典炎症因子,Western blotting的结果表明,TNF-a刺激可增加大鼠脊髓星形胶质细胞中NF-kB信号通路的激活程度,并且还显著上调了Nanog的m RNA和蛋白的表达水平。si RNA敲低Nanog可抑制TNF-a诱导星形胶质细胞中CD44和Musashi-1的表达,提示在星形胶质细胞的去分化过程中需要Nanog的参与。另外,Nanog基因敲低并不影响NF-kB信号的激活。NF-kB信号通路与Nanog均参与了炎症诱导的星形胶质细胞去分化过程,为了充分了解二者之间的相互调节关系,利用通路抑制剂BAY11-7082抑制NF-kB信号通路。结果表明BAY11-7082阻断了NF-kB信号通路,同时还抑制了未成熟标志物的表达,充分说明了TNF-a通过NF-kB信号通路诱导星形胶质细胞去分化。BAY11-7082还能抑制Nanog的表达,表明Nanog受到了NF-kB信号通路的调控。另外,Nrg1可诱导原代去分化的星形胶质细胞在翻译和转录水平均表达少突胶质细胞标志物PDGFR-α和O4。体内对SCI的大鼠进行髓鞘内递送Nrg1也可以促进星形胶质细胞表达少突胶质细胞谱系的标志蛋白,表明Nrg1可直诱导星形胶质细胞向着少突胶质细胞谱系细胞转化。此外,PI3K-AKT-m TOR信号通路和众多的转录因子均参与了少突胶质细胞分化的调节。为了深入探讨Nrg1作用机制,利用Western blotting检测结果发现Nrg1可显著激活PI3K-AKT-m TOR信号通路,并且还上调了促进少突胶质细胞分化的众多关键转录因子的表达,包括Olig1,Nkx2.2,Olig2,SOX10和Myrf。Nrg1与Erb B抑制剂联合应用可显著逆转Nrg1的上述作用,提示Nrg1通过Erb B受体将信号传导到细胞内,并通过PI3K-AKT-m TOR信号通路和众多关键的转录因子发挥作用。Nrg1促进星形胶质细胞向着少突胶质细胞谱系转化,为SCI的修复提供可能。LFB髓鞘染色联合对MBP含量的检测显示,Nrg1治疗之后可显著改善SCI之后的脱髓鞘的病理改变。髓鞘的增加常伴有轴突的增加和保护,对NF-H的表达的观测也表明了Nrg1在SCI之后也发挥着保护轴突的作用。Nrg1对星形胶质细胞分化命运的转变,可能对SCI中以星形胶质细胞增殖为主要特征的胶质增生有所影响。同样方法检测GFAP的结果显示Nrg1可显著降低SCI之后胶质增生。所有Nrg1的功能效果提示,其可能有利于SCI大鼠运动功能的恢复。于是我们观测了大鼠42天的运动功能恢复情况,结果显示Nrg1可改善SCI大鼠的BBB评分。并且,Nrg1与Erb B抑制剂联合应用均可抑制Nrg1的治疗效果,表明了Nrg1作用的特异性。研究结论这些结果表明TNF-a通过激活NF-kB信号通路上调Nanog引发星形胶质细胞去分化反应。另外,Nrg1可以通过PI3K-AKT-m TOR信号通路和关键的转录因子诱导去分化的星形胶质细胞转化为少突胶质谱系细胞,并抑制SCI之后星形胶质细胞增生,促进髓鞘再生,保护轴突,最终改善大鼠运动功能。综上所述,这些结果增加了对星形胶质细胞去分化机制的理解,并且丰富了Nrg1修复SCI的机制,为SCI新的治疗策略的开发提供了理论基础。