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研究背景和目的:再灌注治疗是急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）患者的首选治疗方案,及时有效的重建冠脉血流、挽救缺血心肌,是限制心肌梗死面积、改善心功能的最有效手段。但AMI患者在梗死血管恢复血供后,常并发无复流、心肌顿抑、再灌注心律失常、不可逆的心肌细胞死亡等心脏不良事件,导致心肌缺血/再灌注损伤（Myocardial ischemia/reperfusion injury,IRI）,大大限制了临床治疗的获益。IRI损伤机制复杂,研究表明RNA的m6A修饰、铁死亡在IRI中起着重要作用,深入阐明其发病机制,寻找有效治疗靶点,具有重要临床意义。RNA的m6A修饰作为一种转录后修饰,在缺血性心脏病及缺血再灌注损伤时m6A水平显著升高,提示m6A修饰在心肌保护过程中起重要作用,但在心肌IRI过程中的作用及机制不详,值得深入研究。去甲基化酶ALKBH5是甲基化修饰的关键调节酶。研究证实ALKBH5在心肌细胞增殖、心肌修复方面起着极为关键的调控作用,但ALKBH5在急性心肌梗死、心肌IRI过程中的调控机制不明,需要深入研究。另外,研究证实铁死亡与心血管系统疾病密切相关,且铁死亡抑制蛋白1（FSP1）在调控铁死亡过程中扮演重要的作用。在本研究中,本课题构建了心肌缺血再灌注损伤的小鼠模型,首先观察甲基化转移酶和去甲基化转移酶表达情况,再观察ALKBH5对心肌缺血再灌注时心功能的影响及与FSP1表达的相关性。通过细胞实验明确FSP1是ALKBH5甲基化修饰激活铁死亡的重要靶点,最后阐明ALKBH5介导FSP1甲基化修饰影响铁死亡信号通路的分子机制,为缺血再灌注心肌损伤的防治提供新思路和新靶点。方法:1、构建小鼠心脏缺血再灌注损伤模型,比色法检测心肌组织RNA中m6A甲基化水平;q RT-PCR检测IRI组心肌组织甲基转移酶METTL3、METTL14表达水平变化以及去甲基化酶ALKBH5、FTO表达水平的变化;q RT-PCR检测了m6A关键修饰酶在IRI损伤心肌组织中的表达变化;Dot Blot检测IRI组心肌组织总m6A水平表达情况;Western Blot检测IRI组心肌组织ALKBH5蛋白表达情况。2、SD乳鼠1-2天龄原代心肌细胞分离培养和免疫荧光鉴定,CCK-8检测心肌细胞活力和心肌细胞缺氧4小时后复氧细胞活力的变化;进一步使用比色法检测心肌细胞RNA中m6A甲基化水平;Dot Blot检测H/R组心肌细胞总m6A的水平的变化;q RT-PCR和Western blot检测H/R组心肌细胞中ALKBH5m RNA和蛋白表达情况。3、Ad-ALKBH5转染心肌细胞36小时后,再进行H/R处理,q RT-PCR和Western blot检测ALKBH5m RNA和蛋白表达情况,并通过CCK-8检测心肌细胞活力的变化,此外,我们通过TMRE染色检测心肌细胞线粒体膜电位的变化。4、通过心尖注射Ad-ALKBH5,过表达小鼠;36小时后再对小鼠进行IRI处理,经胸心脏彩超,检测小鼠心脏功能的变化,进一步通过检测小鼠血清中c Tn I的含量和LDH活性的变化。观察过表达ALKBH5后,小鼠左室射血分数、左室短轴缩短率的变化,以及通过TTC/Evans Blue染色检测心肌梗死面积的变化。5、过表达心肌细胞中ALKBH5的表达,然后缺氧复氧,通过DCF-HC染色和FACs检测心肌细胞ROS强度的变化,并检测H/R时心肌细胞铁死亡标志物MDA、铁蛋白、二价铁的变化和ELISA检测小鼠血清中GSH水平的变化。6、Ad-ALKBH5转染心肌细胞36小时后再进行H/R处理,RNA-Seq检测铁代谢相关信号通路的变化,并通过West blot和SRAMP预测等实验手段明确ALKBH5是否通过调控FSP1的m6A修饰促进FSP1蛋白表达的具体机制。结果:1、小鼠心脏缺血再灌注损伤24小时后,心肌组织总m6A的水平显著升高,去甲基化酶ALKBH5表达水平显著降低。2、比色法检测心肌组织RNA中m6A甲基化水平,IRI组心肌组织总m6A的水平显著升高;q RT-PCR检测结果发现IRI组心肌组织甲基转移酶METTL3、METTL14表达水平显著升高,去甲基化酶ALKBH5表达水平显著降低、而FTO表达变化不明显;Dot Blot检测,IRI组心肌组织总m6A水平显著升高;Western Blot检测,IRI组心肌组织ALKBH5蛋白水平显著降低。3、CCK-8实验和TMRE染色结果显示过表达ALKBH5显著缓解H/R诱导的心肌细胞损伤。4、通过心尖注射Ad-ALKBH5,36小时后再对小鼠进行IRI处理,心脏彩超结果过表达ALKBH5,显著升高LVDP及+dp/dt,降低LVEDP及-dp/dt,且与时间相关,使小鼠左心室收缩及舒张功能得到明显改善;ELISA结果发现过表达ALKBH5后小鼠血清中c Tn I的含量增加;同时,过表达ALKBH5显著降低LDH的活性;TTC/Evans Blue染色检测心肌梗死面积,结果发现过表达ALKBH5减轻IRI导致的心肌梗死。5、过表达ALKBH5抑制H/R诱导的铁死亡。6、RNA-Seq结果分析发现H/R激活心肌细胞铁死亡信号通路,过表达ALKBH5可显著逆转其诱导的铁死亡;q RT-PCR结果发现H/R时FSP1表达减少,过表达ALKBH5促进FSP1表达;Western Blot结果进一步证实发现H/R时FSP1表达减少;过表达ALKBH5促进FSP1的表达;通过SRAMP预测发现FSP1基因m RNA序列中含有多个潜在的m6A甲基化位点,其中962 bp位点具有高保守性;Me-RIP检测心肌细胞FSP1的m6A修饰,H/R时FSP1的m6A修饰增加,过表达ALKBH5抑制了FSP1的m6A修饰;转录抑制试验分析FSP1 m RNA的衰减率,结果发现过表达ALKBH5可显著减少FSP1 m RNA的衰减。结论:心肌缺血再灌注损伤时,ALKBH5表达减少;过表达ALKBH5可抑制FSP1的甲基化修饰增加其表达,进而抑制铁死亡信号通路,最终保护心肌细胞。