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宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,发病率位居女性恶性肿瘤第2位。HPV16和HPV18是导致宫颈癌最主要的两种高危型HPV病毒,其感染与70%以上的宫颈癌发病率有关。E6和E7是常见高危型HPV16和HPV18型引起的恶性转化中起关键作用的两个蛋白。目前已证实HPV18 E6、E7为肿瘤排斥抗原,能够诱发CTL反应,利用E6、E7制备的疫苗对肿瘤具有一定的治疗作用。本项实验中,分别对E6和E7蛋白的锌指结构进行突变以降低其致癌性,同时保证不改变E6和E7蛋白免疫原性和稳定性。此外对E6、E7的基因序列进行密码子优化以使突变后HPV18-E6/7融合蛋白能够在乳酸菌中高效表达。对突变后的HPV18-E6/7融合蛋白的信号肽、初级结构和高级结构进行生物信息学方法分析,发现突变后的HPV18-E6/7融合蛋白是分泌蛋白,有疏水性,可能以一种包涵体的形式存在于乳酸菌中。因此我们将优化突变后的HPV18-E6/7融合基因重组克隆到表达载体pET30a(+),IPTG诱导其表达。将表达的HPV18-E6/7蛋白对小鼠进行皮下免疫,免疫一个月后采集血清,间接ELISA和Western blot分析免疫后小鼠血清的抗体水平,结果表明小鼠的血清效价为1:5000,可用于乳酸菌表达突变的HPV18-E6/7融合蛋白的检测。将突变后HPV18-E6/7融合基因克隆到乳酸菌表达载体pMG36e,在乳酸菌MG1363中高表达HPV18-E6/7融合蛋白,Western blot检测乳酸菌特异性表达的HPV18-E6/7融合蛋白。结果表明,含重组质粒pMG36e-HPV18-E6/7的乳酸菌MG1363已表达HPV18-E6/7融合蛋白。乳酸菌疫苗的粘膜免疫能够刺激机体产生强烈的粘膜免疫反应,因此本实验采用口服、滴鼻和阴道免疫三种不同的粘膜免疫方式对小鼠粘膜接种表达HPV18-E6/7融合蛋白的乳酸菌,Western blot、间接ELISA和脾脏IFN-γ免疫组化检测重组乳酸菌引起的粘膜免疫反应,结果表明三种免疫方式均能激发机体免疫反应,且效果分别为口服免疫﹥滴鼻免疫﹥阴道免疫。总之,本实验构建乳酸菌重组质粒pMG36e-HPV18-E6/7,探讨重组表达HPV18-E6/7融合蛋白的乳酸菌疫苗的最佳免疫方式,研究表达HPV18-E6/7融合蛋白的乳酸菌对HPV18型的预防和治疗作用,最终为HPV18的临床治疗提供一种新策略。