论文部分内容阅读
目的酸枣仁汤出自于汉代张仲景的《金匮要略·血痹虚劳病》,主治虚劳虚烦不得眠,有清热除烦、养血安神的功效。方中酸枣仁、茯苓、甘草为药食同源药材、川芎和知母为可用于保健品的药材。本课题致力于将酸枣仁汤开发成中药保健品宁心安神口服液,从其制备工艺、质量控制方法、保健功能及安全性的评价等方面展开研究,将经典中药处方与现代制剂技术相结合,进一步发掘传统中药价值的同时促进中药保健品健康产业的发展。本课题建立了宁心安神口服液的HPLC含量测定方法,以酸枣仁汤的含量、改善睡眠作用及对小鼠神经递质的含量影响为指标,对宁心安神口服液的处方配伍进行筛选,然后通过响应曲面设计实验优化酸枣仁汤的提取工艺。以汤剂为基础,对加入的澄清剂、矫味剂、防腐剂等附加剂进行筛选,确定宁心安神口服液的制备工艺。采用正常小鼠模型,对酸枣仁汤和宁心安神口服液改善睡眠的保健功能进行评价,并检测小鼠脑中神经递质含量的变化;通过急性毒性实验和最大耐受量实验对宁心安神口服液的安全性进行评价。对宁心安神口服液中各味药进行薄层鉴别并对其HPLC含量测定方法进行考察,建立初步的质量标准草案。并利用网络药理学技术研究预测宁心安神口服液改善睡眠的作用机制。方法1.分别用低、中、高不同剂量的两种不同配伍的酸枣仁汤给小鼠灌胃30天,对两种酸枣仁汤的改善睡眠功能进行评价比较,检测小鼠脑中NE、5-HT、DA、GABA和Ach等五种神经递质含量,计算小鼠重要器官的脏器指数,并对两种酸枣仁汤中斯皮诺素、芒果苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸铵、酸枣仁皂苷A和知母皂苷BⅡ的含量进行检测,综合考虑筛选出宁心安神口服液的最佳处方配伍。以酸枣仁汤水提液中七种成分的总含量为指标,采用相应曲面设计实验对酸枣仁汤的提取工艺进行优化,根据单因素考察结果,选择加水量、提取时间、提取次数三个因素为考察对象,用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行优化得出最佳提取工艺,并通过工艺验证,保证提取工艺稳定可行。以七种对照成分的总含量和制剂的澄清度为主要指标,分别对澄清剂、矫味剂、防腐剂的种类和用量进行考察优化,其中澄清度的检查依据药典澄清度检查法（通则0902）,第一法目视法。确定宁心安神口服液的制剂工艺。2保健功能评价是将正常小鼠分成7个组,酸枣仁汤和宁心安神口服液分别浓缩至低、中、高三个浓度,灌胃30天后观察其对巴比妥类药物诱导的睡眠时间、入睡率及睡眠潜伏期的影响,以此评价其改善睡眠的保健作用。并对小鼠脑中的NE、5-HT、DA、GABA和Ach等五种神经递质进行试剂盒检测。3.宁心安神口服液的安全性评价中,动物适应性饲养一周后随机分为4组,每组10只,分别灌胃给予蒸馏水及低、中、高不同浓度的宁心安神口服液,观察每组小鼠给药后的反应。连续观察14 d,计算其LD50;以可承受的最大浓度和最大体积的药量给小鼠灌胃,一天三次,灌胃结束后连续观察14天,记录动物的状态,计算宁心安神口服液的最大耐受量,综合评价宁心安神口服液的安全性。4.对宁心安神口服液进行质量控制,建立宁心安神口服液的感官指标;采用薄层色谱法对宁心安神口服液中的各味药材进行鉴别;建立宁心安神口服液的PH、微生物限量、污染物限量等标准;采用高效液相色谱法建立宁心安神口服液中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、知母皂苷BⅡ、芒果苷、阿魏酸、甘草苷以及甘草酸铵含量测定的含量方法。5.利用中药系统药理学分析平台TCMSP数据库寻找与宁心安神口服液中5味中药相关的化学成分及其作用靶点,并BBB（血脑屏障）≥0.3进行筛选,通过DurgBank数据库获取与失眠相关的靶标,将得到的治疗失眠的靶标导入STRING,利用STRING构建疾病网络;采用DAVID数据库对相关潜在作用靶点进行GO富集和KEGG代谢通路富集分析。结果1.宁心安神口服液的最佳配伍为酸枣仁:茯苓:知母:川芎:甘草的用量为15g:6g:6g:6g:3g。宁心安神口服液的最佳提取工艺为加9倍量的水,浸泡30min,回流提取3次,每次1.5小时;最适宜澄清剂为HACC澄清剂,当药液比为1:2时,用2%A液和6%B液澄清效果最好;矫味剂选择0.05%三氯蔗糖;防腐剂选择0.02%尼泊金乙酯。2.酸枣仁汤和宁心安神口服液均能延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间、增加戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率、缩短巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期。灌服酸枣仁汤和宁心安神口服液均可使正常小鼠脑中NE、5-HT、DA、GABA含量显著提高,同时Ach含量显著降低,但随着用药量的增加,药物对神经递质的含量影响减弱。3.当宁心安神口服液的给药量为60000mg/g时,无动物死亡;经计算,小鼠对于宁心安神口服液的最大耐受量为人日用量的250倍,说明宁心安神口服液安全性良好。4.五种药材薄层色谱分离度好且无阴性干扰,表明专属性良好;建立了宁心安神口服液中酸枣仁皂苷A、斯皮诺素、知母皂苷BⅡ、芒果苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸铵的HPLC含量测定方法。其中酸枣仁皂苷A的回归方程为Y=1.5019X+10.2133,斯皮诺素的回归方程为Y=12963136.8807X-56925.7677,知母皂苷BⅡ的线性方程为Y=1.5417X+5.4534,芒果苷的回归方程为Y=2×107X-130897,阿魏酸的回归方程为Y=1×107X-7653.8,甘草苷的回归方程为Y=19822010.6086X-100587.7811,甘草酸铵的回归方程为Y=2693854.254X-53841.2587,相关系数均在0.9990以上。方法学考察说明该方法专属性准确性良好,可用于酸枣仁汤的质量控制。5.宁心安神口服液中,共筛选出58个与失眠相关的潜在活性成分和211个潜在作用靶点;KEGG富集得到6条代谢通路,包括神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路、cGMP-PKG信号通路等。结论本课题筛选出适合作为保健品开发的宁心安神口服液的最佳配伍,通过响应曲面设计的方法确定了宁心安神口服液的最佳提取工艺,选出适合宁心安神口服液的澄清剂HACC、矫味剂三氯蔗糖及防腐剂尼泊金乙酯,并确定了最佳用量,确定了宁心安神口服液的制备工艺。通过对巴比妥钠类药物的协同作用以及脑内神经递质含量测定实验,对酸枣仁汤和宁心安神口服液的保健功能进行了评价,证实了酸枣仁汤和宁心安神口服液的药效的一致性,说明宁心安神口服液有改善睡眠的作用。急性毒性实验和最大耐受量实验结果表明宁心安神口服液安全性良好,安全无毒。主要通过对各味药材的薄层鉴别和含量测定方法的研究,初步建立了宁心安神口服液的质量控制方法。网络药理学研究结果印证了宁心安神口服液对于改善睡眠的多成分、多靶点、多途径的作用特点,预测了其可能作用机制可能与调节神经递质受体表达及调节神经递质含量有关。