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目的:(1)研究PML蛋白Ring和B-box(1&2)结构域中锌指结构对三氧化二砷(As203,其水溶形式为亚砷酸iAs111,下文简称其为砷剂)诱导PML蛋白降解的作用机制,通过螯合其锌离子或破坏不同结构域中的锌指结构,确证锌指结构的完整性对砷剂降解PML蛋白的必要性。(2)通过研究PML蛋白的突变体,观察PML核体形成及SUMO化的招募情况,揭示PML突变体影响PML-NBs核小体形成和SUMO的机制,进而阐明砷剂无法降解突变体PML的分子机理。方法:本课题研究内容主要由以下三大部分构成:第一部分,利用金属螯合剂1,10-邻菲罗啉(1,10-Phenanthroline monohydrate)螯合以去除 PML 蛋白 Ring和B-box(1&2)结构域中锌指结构的锌离子,经砷剂处理后,Western Blot检测砷剂是否依然可以诱导PML蛋白由核质转移至核基质(即由RIPA裂解液的可溶部分转变至不可溶部分),并用免疫荧光法观察PMLNBs形成情况,从而确定锌指结构对于砷剂诱导PML蛋白降解的重要作用。第二部分,分别对PML V蛋白Ring,B-box 1,B-box 2结构域中锌指结构中的部分半胱氨酸残基或组氨酸残基进行点突变,砷剂处理后Western Blot检测PMLV及其突变体蛋白溶性转变情况,进而推测各个结构域内锌指结构的破坏及重组情况。第三部分,载体细胞293T中瞬转PMLV蛋白突变体,并予以砷剂处理后,免疫荧光法检测核体的形成及相关蛋白SUMO-1的招募情况,进一步阐明保持锌指结构的完整性对于砷剂降解PML蛋白的重要作用。结果:第一部分,(1)由免疫荧光共聚焦显微镜可观察到在金属螯合剂1,10-邻菲罗琳(1,10-Phenanthrolinemonohydrate)预处理后,人急性早幼粒细胞白血病细胞NB4在接受砷剂暴露后无法形成核体,且无法招募SUMO-1蛋白;(2)同样用锌螯合剂预处理PML-IV和PML-V过表达的293T细胞或HeLa细胞,发现砷剂砷诱导PML蛋白的溶性改变被抑制,表明PML蛋白的锌离子或锌指结构完整性是砷剂降解PML蛋白的基本条件。第二部分,在第一部分实验基础上,我们在第二部分工作中构建了数十例PMLV突变体,即破坏Ring和B-box(1&2)中的原有的锌指结构,WesternBlot实验结果提示,破坏锌指结构的可导致砷剂无法诱导PML蛋白的溶性改变和降解,证明了锌离子或锌指结构对砷剂降解PML的重要性。第三部分,由第三部分实验结果发现,PMLV蛋白突变体可导致砷剂诱导PML蛋白本身SUMO-1修饰延迟。结论:(1)锌指结构的完整性对于三氧化二砷降解PML蛋白起到至关重要的作用,原因为其完整性直接影响到PML溶性转变以及核体的形成。此外,在原有的锌指结构被破坏的基础上,我们还发现有些半胱氨酸和组氨酸残基可重新形成新的锌指结构,以维持其结构功能,进而PML蛋白被砷剂降解。(2)通过构建多种PML蛋白突变体,研究砷剂诱导PML蛋白招募SUMO-1修饰,发现PML蛋白的任意突变体都可导致PML蛋白SUMO-1化的延迟,首次证明,突变型PML蛋白可影响砷剂招募SUMO-1的功能。