研究背景:慢性肝病是常见疾病,据估计2019年国内肝硬化人数预计为160万。肝硬化患者伴肝性脑病的发生率至少为30%-45%。目前国内用于肝性脑病预防及治疗的主要药物有门冬氨酸鸟氨酸、乳果糖、拉克替醇,利福昔明-α。其中利福昔明-α是利福霉素衍生物,口服吸收少,主要在肠道发挥药效作用,2013年《中国肝性脑病诊治共识意见》推荐利福昔明-α为预防肝性脑病复发的常用药物。人体肠道菌群种类多样,含有细菌,古菌,真菌,病毒多种微生物。这些肠道菌群不仅有维持人体能量代谢,稳态等多种重要生理学功能,还可以影响人类的心理跟行为,肠道菌群的失衡会引起多种严重的疾病。同时肠道菌群也是“细菌耐药基因库”,在肠道特殊的空间内,不同细菌间基因交流比较频繁,有利于耐药基因的播散。利福昔明-α为肠道作用的抗菌药物,目前关于肝硬化病人长期预防性使用利福昔明-α前后,肠道菌群,肠道耐药组改变情况的临床研究很少,相关机制的研究也罕见报道。研究目的:明确肝硬化病人长期预防性使用利福昔明-α对肠道菌群的影响,分析肠道微生物组耐药性的变化情况,探究利福昔明-α对肠道菌群的作用机制,为肝硬化病人合理长期预防性使用该药物提供依据。研究方法:通过入选标准及排除标准选取肝硬化患者为研究对象,经患者知情同意后,服用利福昔明-α药物12周,根据研究流程表定期对患者进行体格检查,临床表现随访,记录合并用药情况,检查血常规,尿常规,肝、肾功能,CTP评分,评估患者依从性,记录患者的不良反应。分别于患者服用利福昔明-α药物前1天、用药后1、2、4、6、8、10、12周,采集患者粪便标本,提取宏基因组,进行二代高通量测序。采用生物信息学方法分析患者用药过程中菌群结构、菌群多样性、菌群功能的变化情况,分析肠道耐药相关基因种类,数量及丰度的变化情况,了解利福昔明-α对肠道菌群中菌株基因组的影响。研究结果:第一部分肝硬化患者长期服用利福昔明-α对肠道菌群影响的临床研究1.本研究共纳入37名研究对象,其中完成服药周期有21名患者,平均年龄56周岁,男女性别比例为13:8,完成疗程患者中,5名患者发生肝性脑病,有4名患者有腹泻症状,无其他并发症。2.利福昔明-α服用过程中肝硬化患者血氨浓度降低,NCT,DST结果改善,其他生化指标无明显改变。3.采集完成研究周期的21名患者粪便标本164份。第二部分肝硬化患者长期服用利福昔明-α对肠道菌群的影响1.提取粪便宏基因组经检测合格151份(来自20名患者),完成测序后每个样本测序数据量大于10G。2.基于物种主成分,主坐标分析,按照不同病人进行分类,不同病人肠道菌群组成结构无显著性差异。按照服药时间分组,患者不同时间肠道菌群结构无显著性差异。3.肝硬化患者整体服用利福昔明-α期间,香农指数及西普森指数均未发生明显变化,分别稳定在2.3及0.8左右,肠道菌群的多样性未发生明显变化。4.肝硬化患者肝性脑病的发生是由于肠道菌群埃希菌属、克雷伯菌属、韦恩菌属等菌株增长导致的菌群失衡引起,发作过程中菌群多样性降低。利福昔明-α对这些菌株的抑制作用较小。5.肝硬化患者与健康对照组相比有43个有统计学差异的宏基因组物种(MGS),其中19个MGS在健康组富集,24个在肝硬化患者组富集。6.利福昔明-α服药期间健康组富集的19个MGS中,有9种发生富集。肝硬化组富集的24个MGS中,17个发生减少,其余MGS未发生明显改变。7.患者服用利福昔明-α期间,肠道菌群代谢通路绝大多数保持相对稳定,仅有涉及分支氨基酸代谢,瓜氨酸生物合成,几丁质降解等少数代谢通路发生改变,其中脂多糖,芳香氨基酸代谢通路降低。发作肝性脑病患者肠道菌群脂多糖代谢增强。第三部分肝硬化患者长期服用利福昔明-α对肠道菌群耐药组的影响1.肝硬化患者肠道菌群中总共注释出1845种不同的耐药基因,根据对抗菌药物的耐药种类,这些耐药基因分为37类。其中含量最多的五种类型是青霉素类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类耐药基因。根据丰度分析,含量最多的耐药基因是tetQ基因。2.肠道菌群中的耐药基因多由肠杆菌科细菌携带,菌群的丰度的改变导致耐药基因的波动。3.肝硬化患者肠道耐药基因的数量及丰度在服用利福昔明-α过程未发生显著性变化,利福霉素相关耐药基因数量及丰度服药期间未发生明显变化。4.发作肝性脑病患者质粒携带情况与未发生肝性脑病患者差异的原因是由于肠道菌群的差异。5.肝硬化患者肠道菌群中含量最多的质粒类型是IncFIB质粒,患者在服用利福昔明-α期间质粒种类及数量未发生明显改变。6.肝硬化患者肠道菌株携带插入序列类型较多,约为1200种,患者在服用利福昔明-α期间插入序列数量及种类未发生明显改变。第四部分肝硬化患者长期服用利福昔明-α对肠道菌株基因组的影响1.肝硬化患者长期服用利福昔明-α会导致肠道菌群中共35种菌株发生同一物种不同株的菌株替换,所有患者共有的菌株替换有10种。2.肝硬化患者长期服用利福昔明-α会导致肠道菌群中43种菌株发生不同数量的单核苷酸变异(SNV),大于100个SNV的菌株有20个,其中9种菌株是第二部分研究中鉴定的肝硬化患者肠道中存在的异常菌株。3.发生菌株替换或SNV的菌株与原始菌株相比,生长速率有所改变,因此导致服用利福昔明-α过程中菌群丰度发生变化。结论:1.肝硬化患者对利福昔明-α耐受性良好,长期服用利福昔明-α可以改善血氨及神经生理功能。2.肝硬化患者长期服用利福昔明-α对肠道菌群整体的结构、功能、菌群多样性影响较小。3.肝硬化患者与健康对照组相比存在异常丰度菌株,长期服用利福昔明-α会降低肝硬化肠道内富集的菌株,增加在健康对照组肠道富集的菌株的丰度。4.长期服用利福昔明-α可以对肝硬化患者肠道菌群中者异常的菌株发挥调节作用,但是对由于肠杆菌科菌株失衡导致的肝性脑病发作无明显抑制效果。5.肝硬化患者长期服用利福昔明-α不会改变肠道菌群耐药基因种类及丰度,与利福霉素相关的耐药基因也未发生明显改变,服药期间肠道菌群可移动元件数量及种类保持稳定。7.肝硬化患者(包括发作过肝性脑病患者)其肠道抗生素耐药基因及可移动元件主要由肠杆菌科细菌携带,菌群丰度的改变导致耐药基因及可移动元件的变化。6.长期服用利福昔明-α会导致肠道菌群发生同种菌株替代或菌株SNV,这些变异导致菌株的生长速率改变,是利福昔明-α调节肝硬化患者异常肠道菌群丰度的原因。