β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是降解昆虫体内几丁质的关键酶之一,具有调控昆虫发育、变态和生殖等功能,是一种重要的糖苷酶。几丁质被分解时,首先几丁质酶降解几丁质成小分子的寡聚物,之后被β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶降解为单分子的N-乙酰氨基葡萄糖。本研究克隆甘蓝夜蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶全长c DNA序列,对基因推导的氨基酸序列进行分析,构建了进化树,并进一步在大肠杆菌中成功表达了该序列的蛋白,进行纯化和复性,获得了有活性的目的蛋白,为β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶蛋白今后的研究奠定了基础。针对基因的时空表达进行研究,同时,体外注射蜕皮激素和ds RNA对β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因进行功能的研究。本试验扩增得到甘蓝夜蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的全长c DNA序列,命名为Mb NAG(Gen Bank登录号:KP730442)。该基因含有2445 bp,包括一个开放读码框大小为1782bp,编码一个多肽含有594个氨基酸,其相对分子量大小约为67.8 k Da,等电点为5.11。该序列含有G20家族保守活性位点HMGGDEVSERCW,判定该基因属于GH20家族中的一员。推导得到的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因含有三个N-位糖基化位点。与甘蓝夜蛾与八字地老虎和小地老虎的一致性达到85%和84%,综上所述,本试验克隆的基因是甘蓝夜蛾的一条新的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因。原核表达成功表达外源蛋白,分子量与预测融合蛋白分子量相符,表达的蛋白为包涵体蛋白,蛋白经过充分洗涤、纯化、复性获得纯的目的蛋白,蛋白经SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明该蛋白为目的蛋白。复性及活性检测结果表明,随着p H的升高,重组蛋白活性先升高后降低,p H=7时活性最高为39.33 U/m L;随着温度的升高,蛋白的活性先升高后降低,在温度为34℃时活性最高为31.33 U/m L。利用荧光定量PCR技术检测基因表达量的变化,结果表明,该基因在甘蓝夜蛾的不同发育阶段和不同组织中都有mRNA水平的特异性表达,1-6龄虫体基因的表达量逐渐升高,预蛹期表达量最大,蛹期又降低。在围食膜中该基因的表达最高,是前肠的54倍。Real-time PCR分析激素处理后Mb NAG基因表达量的变化。结果表明,浓度为2μg/μl,基因的表达变化不明显,与对照趋势相同;浓度为6μg/μl和18μg/μl时基因表达量在48 h达到最大,分别是对照的3.92和6.56倍;表明该基因的表达受蜕皮激素影响,且浓度为18μg/μl时变化明显。RNAi结果表明,注射48 h后,处理组虫体中Mb NAG基因表达量下降60%;注射72 h后,处理组下降到67%。同时,试验组虫体出现不能正常蜕皮、羽化和死亡现象,到完全羽化为成虫死亡率达到52%。