目的： 确定薄荷醇对双氯芬酸钠透皮吸收的最佳剂量及复方；考察薄荷醇对双氯芬酸钠镇痛作用的影响；采用体外角质形成细胞(KC)培养法，选取不同浓度薄荷醇作用于。KC，通过MTT法测定细胞存活率，流式细胞术检测薄荷醇对KC线粒体膜电位的影响和KC细胞周期的变化情况；通过丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定来反映薄荷醇对KC细胞内氧化应激水平的影响；应用彗星试验观察薄荷醇对单个KC细胞DNA链损伤作用，依据上述实验结果探讨薄荷醇的对KC的作用情况。 方法： 1透皮吸收试验采用两室扩散池体外实验装置，选取大鼠背部皮肤，以双氯芬酸钠作为模型药物，探讨不同浓度的薄荷醇对药物透皮吸收影响的量效关系，并计算出其累积透过量和渗透系数，用抛物线拟合法求出薄荷醇的最佳浓度；探讨不同浓度的薄荷醇和氮酮联用对双氯芬酸钠透皮吸收的影响，并计算出其渗透系数、滞后时间和稳态流量，用功效系数法评估不同复方的促透效果。 2 镇痛药效试验选用KM小鼠，热板法测定给药后15、30、60、90、120min的痛阈值；用福尔马林法观察注射后5、15、30、45、60 min时动物的行为反应，按4级记分法记录各时间点15秒内出现的最高痛级反应，考察薄荷醇对双氯芬酸钠镇痛作用的影响。 3 薄荷醇对人角质形成细胞的影响 3.1薄荷醇对人KC存活率的影响 将单细胞悬液以每孔1×10<,4>细胞接种于96孔培养板，细胞贴壁生长后更换培养液，加入含系列浓度薄荷醇的DMEM培养液，并设无细胞和血清的培养液调零孔，空白对照组。终止培养前4h，每孔加入MTT溶液20 μ l，之后弃上清液。每孔加150 μ IDMSO，振荡10min，充分溶解结晶。酶标仪570nm处，测各孔吸光度值，计算存活率。 3.2 MDA和SOD测定 将人KC以2.0×10<,5>/ml接种于预铺多聚赖氨酸的24孔板，继续培养4d后，加入薄荷醇使终浓度呈系列浓度，其中用0.1％二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照，新鲜DMEM完全培养基作为空白对照。薄荷醇作用24h后按说明书进行操作，检测细胞内MDA和SOD。 3.3薄荷醇对角质形成细胞线粒体膜电位的影响 取不同浓度薄荷醇作用于KC细胞，利用流式细胞仪(FCM)结合Rh．123染色技术测定细胞线粒体膜电位，观察其荧光强度的变化。 3.4彗星实验 取不同浓度薄荷醇作用于KC细胞，采用彗星实验观察其对DNA的损伤作用。 3．5薄荷醇对角质形成细胞细胞周期的影响 利用流式细胞仪(FCM)结合PI染色技术，检测不同浓度薄荷醇对KC周期的影响。 结果： 1透皮吸收试验不同浓度薄荷醇对双氯芬酸钠的透皮吸收均有促进作用，尤以2％薄荷醇透皮作用最显著，抛物线拟合法得薄荷醇的最佳百分比浓度为3.22％；不同浓度薄荷醇与氮酮联用对双氯芬酸钠透皮效果弱于1％氮酮。 2．镇痛药效试验 2．1热板实验 在各测定时间内各给药剂量组小鼠痛阈值随给药时间延长而逐渐增大，给药后15min和30min各剂量组有一定效果但不明显，给药后60min效果明显，在60～90min达最大，到120min痛阈值不再明显升高，并与生理盐水组相比，痛阈值有显著性差异(P<0.05)。与B组比较，除C组15min，D、E组的60min点镇痛效果差异无显著性(P>0.05)，其余各组各时间点镇痛效果差异有显著性(P<0.05)。 2．2福尔马林实验 与生理盐水组相比，致痛后5min时各剂量组无明显差异(P>0.05)，致痛后15min、30min、45 min和60 min组与其相比有显著性差异(P<0.05)，疼痛分值明显减小。这说明各剂量组药抑制福尔马林Ⅱ相反应，对Ⅰ相反应无明显影响。 3薄荷醇对人KC的影响 3．1薄荷醇对人KC存活率的影响 随着薄荷醇浓度增加，OD值降低明显，细胞存活率逐渐降低，显示KC的体外增殖受到显著抑制，其抑制作用与薄荷醇浓度呈剂量依赖性。薄荷醇浓度在1-1.5 mmol/L肘，对KC的体外增殖约达到半数抑制。 3．2 MDA和SOD测定 加入不同浓度的薄荷醇作用24h后，细胞的MDA水平升高，且明显高于对照组，在0.25-2mmol/L范围内，分别与空白对照组和溶剂对照组相比，差异有显著性(P<0.05)，4mmol/L薄荷醇组差异无显著性，表明薄荷醇作用于角质形成细胞可引起脂质过氧化产物增加；而细胞的SOD水平下降，无明显剂量依赖性，各个薄荷醇剂量组分别与空白对照组和溶剂对照组相比，差异均有显著性(P<0.05)。 3．3薄荷醇对KC线粒体膜电位的影响 在给以不同浓度的薄荷醇后，△ψm下降的程度不断增多，荧光峰不断向左移，即朝荧光强度减少的方向移动，从整体水平上可以看出荧光强度总量的下降，表明随着薄荷醇浓度的加大，其诱导的KC△ψm下降持续而渐进地发生。 3．4彗星实验 0.25mmol/L的薄荷醇即可引起KC出现拖尾现象，随着薄荷醇剂量的增加，损伤程度逐渐加重，4mmol/L组细胞DNA损伤率达到92％。薄荷醇各剂量组与对照组相比较差异具有显著性(P<0.05)，各染毒剂量组间相比较差异无显著性(P>0.05)。 3．5薄荷醇对KC细胞周期的影响 薄荷醇可影响KC生长周期，薄荷醇处理24h细胞周期中G<,1>期细胞比例逐渐减少，S期细胞比例逐渐增加。随着薄荷醇作用浓度的加大，细胞群体内形成以S期为主体G<,2>期比例较少的不平衡状态。 结论： 1．在双氯芬酸钠透皮吸收时，薄荷醇的最佳百分比浓度为3.22％。不同浓度薄荷醇与氮酮联用对双氯芬酸钠透皮吸收，1％的氮酮促透效果最好，薄荷醇和氮酮联用并没有对药物酌渗透产生协同作用。 2．薄荷醇并无镇痛效果，也没有改变双氯芬酸钠的作用机制，但是可增强双氯芬酸钠的镇痛效果。 3．薄荷醇可抑制KC存活率，其抑制作用与薄荷醇浓度呈剂量依赖性；薄荷醇诱导KC线粒体跨膜电位(△ψm)的下降；薄荷醇作用于KC可引起脂质过氧化产物增加；加药后KC的SOD水平下降，无明显剂量依赖性；薄荷醇可引起KC损伤；薄荷醇可影响KC生长周期，细胞周期的阻滞可能是影响因素之一。