胆红素是血红素代谢的最终产物，当胆红素代谢异常，产生增加或排泄减少时，总胆红素超过34.2μmol/L，则出现高胆红素血症，临床上即可形成黄疸。新生儿期，游离胆红素通过血脑屏障，易发生胆红素脑病，又称核黄疸，其死亡率很高。但是具体的发病机制仍未阐明。泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）是真核细胞ATP依赖的非溶酶体蛋白降解系统。UPS在维持细胞的正常稳态、调节细胞的生存中起着关键作用，它的功能抑制可以导致多种神经系统相关疾病。而胆红素可以抑制蛋白酶体的活性和功能，这是否构成胆红素致神经系统损伤的机制？为阐述这一问题，我们在本研究中，采用原代海马神经元和新生SD大鼠，观察胆红素对神经细胞的损伤，探讨胆红素是否通过抑制蛋白酶体的活性和功能，导致胆红素脑病神经元的损伤。　　第一部分：新生大鼠海马神经元培养方法的改进与鉴定　　目的：建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法，以获得高纯度、高活力的海马神经元。　　方法：取出生24h内新生鼠，断头取脑，置于装有预冷D-hanks液的培养皿中，小心分离两侧海马，经0.25％胰酶消化15-20min后，终止消化，200目筛网过滤，离心弃上清，加入含有B27的Neurobasal无血清培养基重悬细胞，将细胞接种在PDL包被的12孔板上。24h后更换含有B27的Neurobasal无血清培养基。倒置相差显微镜下观察神经元的生长状态，MTS法测定不同时间神经元细胞的活力，用Tau-1和MAP2抗体进行免疫荧光实验，鉴定海马神经元的纯度。　　结果：　　1.海马神经元种植3h后，少部分细胞贴壁，单个均匀分布，折光性强，种植6h后，神经细胞表面可呈现单个或者多个层状伪足。12h后，大部分细胞贴壁，多数神经元出现无分支的突起，24h后，细胞完全贴壁，可见双突起和多个突起的神经元。72h后，海马神经元胞体饱满，立体感较强，胞浆丰富，突起之间相互形成突触联系，神经元极性完全建立。5-6d的神经元，胞体较前更饱满，立体感及折光性强，突起极其发达，互相连接，形成密集的神经纤维网络。　　2. MTS法测定结果显示，在培养1-8d时间内，海马神经元随着培养时间的延长，活力增加，第8d细胞活性到达高峰，继续培养时，活力开始下降。　　3.经神经元特异性标记物Tau-1和MAP2免疫荧光鉴定，海马神经元纯度为(95.5±2.4)%，用无血清神经元培养基进行原代海马细胞培养，同时未加阿糖胞苷抑制神经胶质细胞，能够获得高纯度的海马神经元细胞。　　结论：采用无血清培养法，对24h内的新生SD大鼠进行海马神经元原代培养，此方法可靠，可获得高纯度的神经元细胞，同时，细胞活力良好；为了减少神经元的损伤，不采用阿糖胞苷处理，并未发现胶质细胞的生长。该方法为神经疾病体外研究提供理想的细胞材料。　　第二部分：胆红素致神经元损伤及其机制的研究　　目的：在原代海马神经元和高胆红素血症新生大鼠水平，探讨胆红素对神经元的损伤及其可能的作用机制。　　方法：　　1.用胆红素处理原代海马神经元，通过倒置显微镜进行观察、拍照，JC-1检测线粒体膜电位，免疫荧光法及Western-blot检测K48、Ub及凋亡相关蛋白的变化。　　2.新生SD大鼠腹腔注射不同浓度的胆红素3d，2次/d后，观察新生鼠的一般状况并拍照，取脑组织进行HE和尼氏染色，免疫组化及Western-blot检测K48、Ub及凋亡相关蛋白的变化。　　结果　　1.海马神经元培养1d后，加入不同浓度的胆红素继续培养不同时间，结果显示：随着胆红素浓度增高和作用时间的延长，神经元轴突生长受抑制的程度增加，且该抑制作用与蛋白酶体的抑制剂ps341效果相似。　　2.海马神经元培养3d后，加入不同浓度的胆红素继续培养6h、12h、24h，结果显示：随着胆红素浓度的增加和作用时间的延长，海马神经元死亡数量逐渐增多。而加入相同浓度的胆红素前体物质胆绿素，处理相同时间后，发现胆绿素对海马神经元的生长无影响。　　3.海马神经元培养3d后，不同浓度的胆红素处理24h，用线粒体膜电位荧光染料JC-1进行检测，结果发现：随着胆红素剂量的增加，海马神经元线粒体膜电位降低，表明细胞出现凋亡。　　4.海马神经元培养3d后，加入不同浓度的胆红素继续培养不同时间，进行免疫荧光检测发现：随着胆红素浓度的增加和作用时间的延长，Ub的荧光逐渐增强，表明泛素化的蛋白质在神经元内聚集增多，呈剂量和时间依赖关系；作用24h后，25μM的胆红素导致泛素化的蛋白质聚集成团，堆积在突丘部位。Bax， Caspase-3的荧光结果显示：随着胆红素浓度增加，荧光逐渐增加，说明细胞内凋亡蛋白增多，且神经元凋亡数目增多。上述效应与ps341相似。　　5.海马神经元培养3d后，胆红素作用24h，Western-blot检测发现：随着胆红素浓度的增加，泛素化的蛋白质聚集增加，凋亡相关蛋白Bax，Caspase-3增多，并且，根据浓度效应和时间效应推测，胆红素先抑制蛋白酶体的功能，后导致神经细胞凋亡，它们之间有时空关系。　　6.1d龄的新生SD大鼠，腹腔注射50μg/g，100μg/g剂量胆红素，共2次，末次注射12h后，取海马神经元培养，结果显示：注射胆红素后的新生鼠，海马神经元的生长显著抑制，突起长度变短、数量减少，神经细胞存活的数量明显减少，经细胞计数后发现与对照组相比有统计学差异。　　7.新生3日龄SD大鼠腹腔持续注射胆红素3d后显示，随着胆红素浓度增高，一般表现逐渐变差，皮肤黄染加重；HE染色显示：随着胆红素剂量的加大，脑组织神经元细胞逐渐变小，胞浆蛋白聚集和浓缩，浓度为100μg/g时部分细胞核固缩；尼氏染色显示：尼氏小体数目明显减少，颜色逐渐变浅，神经元细胞变小，100μg/g剂量组神经元部分溶解甚至消失；免疫组化实验和Western-blot检测显示结果与海马神经元结果一致，随着胆红素浓度加大，海马组织内凋亡相关蛋白增多，且泛素化蛋白质聚集增加，神经细胞发生凋亡。　　结论：胆红素能导致海马神经元细胞和新生SD大鼠神经元损伤，主要机制是通过抑制蛋白酶体功能，导致神经细胞凋亡实现的。这可能是胆红素脑病的发病机制。