表观遗传学是近半个世纪以来,遗传学领域关注的一大热点。表观遗传学是一门研究没有DNA序列变化的可遗传的基因表达发生改变的学科。表观遗传主要是通过DNA的甲基化、组蛋白的修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等方式控制基因表达。其中,DNA、RNA的甲基化修饰是表观遗传学中调控基因表达的一种极其重要的方式,也是发现最早的表观遗传方式。在近些年对DNA、RNA甲基化修饰的研究中,发现DNA和RNA的甲基化存在多种修饰形式,其中,N6-甲基腺嘌呤修饰和C5-甲基胞嘧啶修饰是生物体中存在丰度较高且对生命过程影响较大的两种修饰类型。长期以来,关于C5-甲基胞嘧啶修饰的研究从未停止,研究结果也颇为丰富,作用机制也更为明确。而N6-甲基腺嘌呤修饰受到研究技术的限制,一直没有较大进展,直至近三年,随着特异性抗体与高通量测序的发展,N6-甲基腺嘌呤修饰在不同物种中的研究取得了巨大的突破。研究发现,无论是DNA还是RNA,都会发生N6-甲基腺嘌呤修饰。DNA N6-腺嘌呤甲基化修饰(6mA)最早在大肠杆菌中发现,随后在多种类型细菌、线虫、果蝇、人、猪、非洲爪蟾、斑马鱼、小鼠中被相继鉴定。RNA N6-腺嘌呤甲基化修饰(m6A)也是生物体RNA上存在的最为保守、广泛的修饰,在病毒、哺乳动物细胞、果蝇、植物以及酵母中都陆续被发现。研究表明参与N6-腺嘌呤甲基化修饰的酶是一类含有MT-A70结构域的家族蛋白,从细菌到高等动物都有这种酶的存在,其中DNA 6mA甲基转移酶主要是由METTL4来完成,而RNA m6A甲基转移酶由METTL3和METTL14形成的复合物来催化。家蚕是一种重要的经济昆虫,一生经过卵、幼虫、蛹、蛾四个不同发育阶段完成其生命周期,已被广泛认为是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物。基于对N6-甲基腺嘌呤修饰的认识,目前在昆虫领域主要集中在对果蝇的研究,因此,本研究拟以家蚕作为对象,鉴定家蚕中是否存在N6-甲基腺嘌呤修饰;鉴定参与修饰的相关酶METTL4、METTL3与METTL14并分析其功能;分析DNA的6mA修饰和RNA的m6A修饰在家蚕基因组、转录组水平上的修饰特征;研究这两类修饰与基因表达调控的关系。主要研究结果如下:1.家蚕DNA 6mA与RNA m6A甲基化修饰及其修饰酶的鉴定通过特异性识别N6-甲基腺嘌呤抗体,采用免疫荧光染色和点杂交实验证实在家蚕的胚胎发育时期存在N6-甲基腺嘌呤修饰,即在胚胎发育1-9天的基因组中存在DNA 6mA甲基化修饰,在胚胎发育1-9天的总RNA中也存在RNA m6A甲基化修饰。通过与人,小鼠,果蝇的DNA 6mA甲基转移酶METTL4,RNA m6A的甲基转移酶METTL3和METTL14进行同源序列比对,在家蚕基因组中鉴定到相应的同源基因,分别命名为家蚕DNA 6mA甲基转移酶BmMETTL4、RNA m6A甲基转移酶BmMETTL3和BmMETTL14。我们发现BmMETTL4,BmMETTL3、BmMETTL14这三个酶都拥有一个共同的结构域MT-A70。通过多序列比对分析,表明家蚕与果蝇、蜜蜂、赤拟谷盗、人、小鼠、斑马鱼、爪蟾的METTL4、METTL3、METTL14这三个基因中MT-A70结构域高度保守,进化树分析发现,家蚕BmMETTL4、BmMETTL3、BmMETTL14这三个基因分别与双翅目的果蝇,膜翅目的蜜蜂,鞘翅目的赤拟谷盗等昆虫聚为一支,而哺乳动物聚为另一支,说明这些基因在进化上也非常保守,与物种间进化关系基本一致。2.家蚕腺嘌呤甲基化修饰酶的功能研究在细胞水平,通过免疫荧光染色和点杂交实验证实了N6-甲基腺嘌呤修饰存在于家蚕BmN4-SID1细胞。我们对BmMETTL4、BmMETTL3、BmMETTL14进行了克隆并构建于表达载体,通过转染进行亚细胞定位分析,结果显示BmMETTL4、BmMETTL3、BmMETTL14蛋白均定位于细胞核中,同时当BmN4-SID1细胞中干涉了BmMETTL4、BmMETTL3、BmMETTL14后,发现相应的DNA 6mA修饰与RNA m6A修饰水平都显著降低,表明这三个蛋白能够参与到DNA和RNA的修饰。进一步通过流式细胞仪对干涉了BmMETTL4、BmMETTL3、BmMETTL14的BmN4-SID1细胞进行细胞周期分析,发现细胞滞留在G1期,无法进入到S期和G2/M期,影响了细胞的正常增殖。而且细胞中干涉了BmMETTL4、BmMETTL3、BmMETTL14后,细胞在有丝分裂中期,染色体无法正确地排列在赤道板上,纺锤体无法正常形成,导致细胞有丝分裂发生紊乱。这些结果表明,BmMETTL4介导的DNA 6mA修饰与BmMETTL3、BmMETTL14参与的RNA m6A修饰调控了细胞的发育过程。3.家蚕DNA 6mA与RNA m6A甲基化修饰对目标基因的调控研究通过特异性识别N6-甲基腺嘌呤抗体富集了含有DNA 6mA和RNA m6A甲基化修饰的片段,并分别进行DNA 6mA-Seq与RNA m6A-Seq分析。结果发现在家蚕基因组上广泛存在DNA 6mA甲基化修饰,在基因区域对6mA甲基化修饰的富集分析发现,DNA 6mA甲基化修饰在基因启动子区修饰程度很高,暗示DNA 6mA甲基化修饰与基因的表达调控密切相关。同时,RNA m6A甲基化修饰在RNA的蛋白非翻译区修饰丰度较低,在外显子和内含子修饰丰度较高,暗示RNA m6A甲基化修饰参与RNA的选择性拼接、RNA稳定性、蛋白质翻译等调控过程。对这两种修饰所参与的基因进行功能分类,发现DNA 6mA甲基化修饰的基因主要参与了生物过程调控、离子转运、蛋白定位等;而发生RNA m6A甲基化修饰的基因则有所不同,主要参与信号转导,具有分子结合活性。结合转录组基因表达数据,我们发现DNA 6mA甲基化修饰与RNA m6A甲基化修饰在调控基因表达方面存在着差异,结果表明DNA 6mA修饰倾向于抑制基因表达,相反,RNA m6A修饰则倾向于促进基因表达,而具体的作用机制还需要进一步研究。