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第一部分结直肠癌相关pi RNAs的筛选背景和目的:结直肠癌在世界范围内的发病率和病死率非常高,严重威胁着人类健康。Piwi蛋白相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,piRNAs)是一类新颖的非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),在多种肿瘤中异常表达。但结直肠癌中piRNA表达谱的变化尚无报道。本部分研究旨在了解结直肠癌中piRNA表达谱的改变,并筛选出结直肠癌相关piRNAs。方法:应用深度测序技术探讨结直肠癌和癌旁组织中piRNA表达谱的差异,并筛选结直肠癌相关piRNAs。应用real-time PCR技术对筛选出的结直肠癌相关piRNAs进行验证,并观察这些piRNAs表达与患者临床病理特征的关系。结果:深度测序结果显示,结直肠癌和癌旁组织中piRNAs的种类分别占小ncRNAs的0.17‰和0.23‰,其表达分别占0.11‰和0.08‰。尽管结直肠癌和癌旁组织中pi RNAs的表达非常低,但却存在明显差异,其总体表达在结直肠癌中上调。我们总共筛选出33个在结直肠癌中上调的piRNAs,2个下调的piRNAs。其中,piR-18849、piR-19521和piR-17724是3个上调最明显的piRNAs。Real-time PCR进一步证实了piR-18849、piR-19521和piR-17724在80例结直肠癌组织中的表达高于其配对的癌旁组织。此外,piR-18849的表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移相关,piR-19521的表达仅与肿瘤的分化程度相关。而piR-17724的表达与患者的临床病理特征之间没有相关性。结论:pi RNAs的总体表达在结直肠癌中上调,其可能参与了结直肠癌的发生。piR-18849和piR-19521有望成为结直肠癌患者预后的指标。第二部分结直肠癌相关pi R-19521增加结直肠癌干细胞样特性背景和目的:复发和转移是导致结直肠癌患者高病死率的主要原因。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是启动肿瘤发生、维持肿瘤生长、导致肿瘤复发和转移的根源,根除CSCs将有望降低结直肠癌患者的病死率。piRNAs参与生殖干细胞干性的维持,而CSCs与生殖干细胞具有相似的特性,提示piRNAs可能也参与调控CSCs的功能。然而pi RNAs是否参与结直肠癌干细胞(colorectal cancer stem cell,CRCSC)样特性的调控,目前尚不清楚。本部分研究旨在明确第一部分筛选出的结直肠癌相关piRNA piR-19521是否调控CRCSC样特性。方法:首先应用real-time PCR技术在结直肠癌组织中观察piR-19521表达与CRCSC标志物表达之间的关系。然后应用无血清培养法从3种结直肠癌细胞系中富集CRCSCs,观察piR-19521在CRCSCs和相应肿瘤细胞中的表达差异。最后在结直肠癌细胞系中过表达piR-19521,在CRCSCs中抑制piR-19521,从体内、体外水平观察piR-19521对CRCSC样特性的影响。结果:我们发现在结直肠癌组织中piR-19521的表达与CRCSC标志物CD29、CD133、CD166和Lgr5的表达呈正相关。piR-19521在CRCSCs中的表达显著高于结直肠癌细胞。过表达piR-19521促进CRCSC标志物与胚胎干细胞标志物SOX2的表达,增加CRCSC亚群的比例。过表达piR-19521促进结直肠癌细胞克隆形成、迁移和侵袭,同时也促进细胞的体内成瘤及肝转移。然而,抑制pi R-19521抑制CRCSC标志物和SOX2的表达,降低CRCSC亚群的比例。此外,抑制piR-19521降低CRCSCs的肿瘤起始和自我更新能力,抑制CRCSCs的体内成瘤及肝转移。结论:结直肠癌相关piR-19521在CRCSCs中表达上调,并促进CRCSC样特性的获得,从而促进肿瘤细胞侵袭及转移,其有望成为结直肠癌治疗的新靶点。第三部分piR-19521通过促进ALX4表达增加结直肠癌干细胞样特性背景和目的:上一部分研究结果表明piR-19521调控CRCSC样特性,但参与这一过程的分子机制目前尚不清楚。本部分研究旨在阐明piR-19521调控CRCSC样特性的机制。方法:应用数字基因表达谱(digital gene expression profiling,DGE)技术,筛选piR-19521调控CRCSC样特性的靶基因,并在细胞水平对靶基因的表达和功能进行验证。应用生物信息学和分子生物学技术阐明piR-19521调控该靶基因表达的分子机制。结果:DGE测序结果显示,过表达piR-19521导致899个基因表达上调,662个基因表达下调。GO功能分析和Reactome通路分析表明这些差异表达的基因参与细胞的多种生物过程,包括与肿瘤发生和转移相关的细胞增殖、细胞凋亡、血管形成以及细胞连接等生物过程。我们筛选出了piR-19521的靶基因ALX4,并进一步证实过表达piR-19521促进ALX4的表达,抑制piR-19521抑制ALX4的表达。CRCSCs中ALX4的表达显著高于结直肠癌细胞。在HCT116细胞中过表达ALX4促进CRCSC标志物和SOX2的表达,增加CRCSC亚群的比例。补救实验结果表明,过表达ALX4可抵抗piR-19521抑制导致的干细胞标志物表达的下降和自我更新能力的降低。在结直肠癌细胞中piR-19521来源于活性增强子元件。piR-19521通过调控其基因座附近区域H3K27ac标记的富集提高增强子的活性。结论:piR-19521通过上调ALX4表达增加CRCSC样特性。首次表明piR-19521可调控增强子的活性,具有增强子RNAs的功能。