论文部分内容阅读
目的视锥细胞营养不良（cone dystrophy,COD）是具有临床与遗传异质性的一类遗传性视网膜疾病。本研究阐明了与常染色体显性视锥细胞营养不良（autosomal dominant cone dystrophy,adCOD）相关的鸟苷酸环化酶激活因子1A（guanylate cyclase activator A1A,GUCA1A）基因的新型错义突变的临床表型和可能的发病机理。方法收集了一个山东省青岛市诊断为常染色体显性视锥细胞营养不良家系,家系内共16人,其中患者7人,男性患者3人,女性患者4人。对所有患者及其家庭成员进行全面的眼科检查,并采集外周血液样本提取基因组DNA。通过目标区域捕获测序方法,捕获并分析523个视觉系统相关致病基因,再通过Sanger测序验证、家系共分离验证和致病性预测,明确致病基因和突变。对突变位点的保守性进行序列分析。使用SWISS-MODEL软件对突变蛋白进行同源建模,分析突变位点对蛋白质结构的影响。构建野生型和突变型的GUCA1A基因的原核和真核表达载体以及视网膜鸟苷酸环化酶1（retinal guanylate cyclase 1,retGC1）真核表达载体,并进行野生型和突变型GST-GCAP1融合蛋白的表达和纯化。应用限制性蛋白质水解、电泳迁移、蛋白稳定性实验来预测突变对蛋白结构的可能变化。野生型和突变型GUCA1A表达载体转染至人胚肾（human embryonic kidney,HEK）-293细胞中,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测单磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）浓度。使用免疫共沉淀法和GST-pull down分析GCAP1和retGC1之间的相互作用,并用免疫荧光染色法观察GCAP1和retGC1在HEK-293细胞中的定位。结果（1）在该家系患者中均检测到GUCA1A基因的错义突变（c.431A>G,p.D144G）,该突变在家系内共分离,并且在200个正常对照中未检测到该突变。（2）GUCA1A编码鸟苷酸环化酶激活蛋白1（guanylate cyclase activating protein 1,GCAP1）。序列保守性分析显示,GCAP1蛋白第144位的天冬氨酸（Aspartyl,Asp）位于与Ca2+结合的EF-4环中,在各物种之间高度保守。SIFT、Polyphen2、PROVEAN和Mutation Taster软件结果均显示p.D144G错义突变可能引起GUCA1A功能的“有害变化”。（3）同源建模表明天冬氨酸突变为甘氨酸（Glycine,Gly）,导致GCAP1中第144位残基与第140位苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe140）或第147位甘氨酸（Glycine,Gly147）之间的氢键被消除了,很可能影响GCAP1的折叠和相关生物学特性。（4）GCAP1-D144G对胰蛋白酶的消化作用更敏感;并且在Ca2+存在条件下,GCAP1-D144G突变的电泳速率变慢;并且其稳定性下降。（5）功能实验表明,在高Ca2+浓度下,GCAP1-D144G激活HEK-293膜中的retGC1,从而显着增加细胞内cGMP水平。（6）免疫共沉淀和GST-pull down实验检测显示,与野生型GCAP1相比,GCAP1-D144G与retGC1的相互作用增加。（7）GCAP1-D144G与retGC1在HEK-293细胞中共定位至细胞膜上。结论本研究在一个中国ad COD家系鉴定出GUCA1A基因的新的错义突变（c.431A>G,p.D144G）。通过功能预测和结构分析,发现了GCAP1-D144G的可能的致病机制,它可能引起与ret GC1相互作用增强,以及ret GC1活性的增加,导致c GMP水平持续升高,最终导致ad COD的发生。