疟疾是一类由疟原虫(Plasmodium spp)感染导致的、经雌性按蚊传播的传染性疾病。与其他生物有显著不同的一个特点是,疟原虫在其发育的不同阶段具有结构不同和时期特异性转录表达的核糖体RNA(rRNA)。疟原虫编码rRNA的基因分为两类,分别是在无性期阶段转录表达的A型rRNA(包括A基因型和B基因型)和主要在有性期/蚊期转录表达的S型rRNA(包括C基因型和D基因型)。本实验室以往的研究表明,D型小亚基rRNA基因(D-ssu)是约氏疟原虫卵囊发育的必需基因,约氏疟原虫虫株间D-ssu序列的变化以及转录时间的差异对卵囊发育有着重要的影响。然而,我们对不同类型的ssu基因在疟原虫不同发育阶段的调节机制仍然认识不足。为了研究ssu基因不同结构域(ES6S和ES9S)的功能,我们采用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将约氏疟原虫By265虫株的D-ssu基因片段替换成N67虫株的D-ssu基因片段,以及对By265虫株的D-ssu基因片段和A/B-ssu基因片段进行相互替换。在提供了同源模板DNA的条件下,我们成功得到了By265-DssuN67-Dssu、By265-DssuBy265-A/Bssu、和By265-A/B-ssuBy265-Dssu等替换型克隆。值得注意的是,在不提供外源DNA修复模板的情况下,我们也获得了许多By265-DssuBy265-A/Bssu,By265-DssuBy265-Cssu和By265-A/Bssuy265-Cssu替换型克隆,研究结果表明约氏疟原虫内源性ssu基因家族的同源性序列可作为模板修复CRISPR/Cas9介导的DNA双链断裂。接下来,我们将27个具有不同替换类型和片段长度的克隆分别感染Balb/c小鼠,以此研究这些替换位点对疟原虫有性期发育的影响。结果显示,大部分ssu替换型虫株在红内期的生长发育与野生型疟原虫By265相似,但是我们发现感染By265-A/Bssuy265-Cssu替换型虫株的小鼠生存率明显上升,尤其是Assu和Bssu双位点替换克隆By265-AssuR1-By265-C71:BssuR1-By265-C131在红内期的原虫率显著降低,结果表明By265-A/BssuBy265-Cssu替换型会影响疟原虫红内期的生长发育。我们也对30个不同的替换型克隆进行了蚊期的表型鉴定,包括卵囊数量、唾液腺子孢子数量的统计以及子孢子感染能力和鉴定。大部分克隆第8天的卵囊数量均出现了明显的变化,在这些克隆中,By265-DssuR2-By265-A/B156、By265-DssuR2-By265-A/B500、By265-DssuR2-By265-C255和By265-AssuR1-By265-D131的子孢子显著减少且不能感染小鼠。为了验证这一表型,我们基于By265-DssuR2-By265-A/B156重新构建了的质粒,通过独立的电击转染实验,得到了与预期相同的替换型克隆。然而,表型分析发现这些虫株在蚊期的发育表现正常,这一结果似乎与卵囊发育缺陷原始虫株的观察结果相矛盾。转染期间产生的脱靶效应或未知突变可能是导致这一结果的原因。基于CRISPR/Cas9系统,本研究在使用和不使用外源模板两种情况下成功地获得了多个约氏疟原虫ssu替换型克隆。研究结果为探索ssu基因在疟原虫发育中的调节功能提供了重要信息。