论文部分内容阅读
遗传转化一直以来都是研究药用植物次生代谢物调控的重要手段。其中,稳定转化具有重现性好的优势。但是,获得稳定转化的毛状根体系或转基因植株往往费时费力,无法满足大量药用植物次生代谢调控相关基因的研究需求。农杆菌介导的瞬时转化以其易操作、低成本、短周期的优势,已被广泛应用于植物功能基因的研究中。然而目前,药用植物的功能基因研究还常使用稳定遗传转化,或一些高成本、高难度的瞬时转化方法(如基因枪、原生质体转化等)。因此,本研究试图在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)、夏枯草(Prunella vulgaris L.)中,建立农杆菌介导的瞬时转化体系,为丹参、夏枯草功能基因的进一步研究提供新的方法与参考。本研究以本氏烟草、丹参、夏枯草为材料,尝试建立农杆菌介导的病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)体系;利用pEAQ载体高效表达次生代谢合成相关基因,异源构建次生代谢合成途径;构建农杆菌介导的幼苗瞬时转化体系。主要得到了以下结论:(1)本试验中,VIGS体系未能在丹参中成功建立。这可能与介导的农杆菌株、菌液侵染浓度、植物材料的生长状态、构建载体病毒株系及植物对病毒的防御机制等因素有关;从丹参的病样叶片中成功鉴定出黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV),为丹参中病毒沉默载体的构建及进一步研究提供了材料与依据。(2)通过pEAQ载体在本氏烟草叶片中高效表达了一个或多个外源基因。这为在烟草中快速有效的表达外源基因,并进一步探究其功能提供了有力方法。多个外源基因的高效共表达也为在本氏烟草中异源构建次生代谢途径提供了可能。(3)农杆菌介导的瞬时转化体系在不同的植物幼苗材料中有着不同的侵染效率。在本试验中,以丹参作为材料在农杆菌介导的VIGS、pEAQ载体的瞬时转化及幼苗瞬时转化这几种瞬时体系中都没能成功。这可能与丹参对外源基因的瞬时表达防御机制有关。夏枯草与烟草幼苗的瞬时转化结果也暗示,这种植物幼苗瞬时侵染效率的差异可能与幼苗个体大小差异与组织致密性等原因有关。(4)利用“FAST+机械损伤”的方法,初步建立了夏枯草幼苗瞬时遗传转化体系,为夏枯草中功能基因的研究提供了有效手段。但是,该体系在胁迫相关的功能基因研究中并不适用。