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诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,i PSCs)来源于基因组重编程后的体细胞,能够自我更新并具有分化成多种细胞类型的潜能。i PS细胞作为胚胎干细胞重要的替代物已经应用于药物研发,体外扩增和血细胞谱系的细胞分化等方面。鉴于i PS细胞在人类疾病模型和再生医学研究的潜在价值,有必要了解其生物学特性,尤其是当细胞暴露于环境基因组毒性物质时,了解这些细胞如何保护基因组稳定性是非常重要的。精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)起源于胚胎发育过程中的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs),是精子发生的祖细胞,具有自我更新和定向分化的潜能,可进行体外培养、冷冻保存和体外移植,在医学和生物学及动物科学方面均有广阔的应用前景。精原干细胞作为一种独特的能够将亲代遗传信息传递给下一代的成体干细胞,其分化能力由自身及其所处的生理、环境条件所决定。当环境条件不适时,精原干细胞就会停止分化,从而影响精子发生,导致雄性生殖机能的异常。六价铬是一种环境致癌物,能产生基因组毒性而导致人类罹患癌症。虽然在终末分化的体细胞中已有研究报道六价铬的毒性与致癌性,但是六价铬在i PS细胞和精原干细胞中的基因组毒性作用及其机制尚未见报道。因此,本研究以六价铬为基因组毒性试剂,双氧水H2O2和阿霉素(Doxorubicin,DOX)为平行对照,检测干细胞中DNA损伤反应信号通路中关键分子元件的激活,包括ATM ser1981,H2AX s139,p53 ser15,p53 ser20和p53 ser392的表达情况。结果显示,六价铬在i PS细胞等干细胞具有独特的DNA损伤反应作用机制。主要结果如下:(1)i PS细胞经六价铬处理后,ATM ser1981的磷酸化表现出独特的双相表达模式;0~1h ATM磷酸化出现,1~24h ATM磷酸化消失,24h~48h ATM磷酸化再次出现。(2)本研究以双氧水(H2O2)和阿霉素(Doxorubicin,DOX)这两种典型的可因氧化应激作用而造成DNA损伤的基因组毒性物质做为诱发因子的平行对照。结果显示,在i PS细胞六价铬与双氧水一样,均引起ATM ser1981的磷酸化呈现相同的双相诱发趋势,表明六价铬诱发的DNA损伤机理可以认为是氧化应激引起的DNA损伤,从而导致的基因组不稳定。(3)依赖于p53的DNA损伤调控通路是细胞应对DNA损伤的天然防护屏障。在正常的情况下,细胞中p53蛋白是被下调的。在三种基因组毒性诱发因子的作用下,在i PS细胞检测到p53 ser15和p53 ser392的磷酸化,但未检测到p53 ser20的磷酸化,说明p53 ser20不参与i PS细胞中DNA损伤信号通路的调控。(4)在体细胞的研究表明p38,Casine kinase 2(CK2)调控p53在ser392位点的磷酸化。本研究采用p38 MAPK抑制剂(SB203580)和CK2抑制剂(TBBz)分别作用于i PS细胞,检测i PS细胞在基因组毒性物质处理后p53 ser392磷酸化状态,研究p38和CK2是否协同或彼此独立参与调控i PS细胞中p53 ser392的磷酸化激活。结果显示,在i PS细胞中,p38 MAPK不参与介导p53的活化,而是CK2介导p53 ser392磷酸化,抑制CK2的表达上调p53 ser392的磷酸化,后者导致p53的活化和p53蛋白水平的升高。(5)铬氧化应激损伤导致精原干细胞中p53表达升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降,促凋亡蛋白Bax表达水平升高,线粒体膜电位下降,引发Caspase蛋白激酶家族发生级联反应,PARP-1出现剪切条带,表明六价铬诱发了精原干细胞出现凋亡。(6)体内实验,进一步验证六价铬引起生殖细胞功能异常:六价铬处理导致小鼠睾丸组织曲细精管直径变小,管周膜不完整,生殖细胞数目减少,阻断早期的精子发生,曲细精管上皮空泡化,间质细胞萎缩,破坏支持细胞和血管网。(7)褪黑激素(Melatonin)可减少六价铬导致的精原干细胞凋亡和保护睾丸组织结构的完整性和雄性生殖功能。综上所述,本研究所得的试验结果表明经六价铬处理所诱发的多能干细胞DNA损伤具有独特的分子机理:ATM感受到DSB而启动DNA损伤反应,使H2AX和转录因子p53迅速磷酸化,p53 ser392位点磷酸化导致p53总蛋白的稳定,CK2抑制ser392位点的磷酸化,揭示干细胞具有独特的DNA损伤调控机制。诸多的环境压力容易造成DNA分子结构上的改变,从而造成DNA损伤而诱发疾病。因此,有必要深入了解干细胞如何应对各种环境毒性物质,从而维持基因组的稳定性。本研究关于六价铬诱发干细胞DNA损伤调节机制的研究发现,可以为生殖机能调控提供依据,为研究其它环境污染导致的疾病发生作用机理研究提供思路和线索,也可为预防和治疗环境污染导致的人类疾病,以及更好的应用于再生医学和药物研发提供指导。