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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus serotype-1,APMV-1)的代表种,其广泛分布于世界各地,也是严重危害世界家禽健康最主要的病原之一。尽管NDV只有单一血清型,但却存在着多种致病型与基因型。NDV各基因型之间的基因组差异性很大。目前,国内外学者通常将NDV分为class I和class II两大类:class I型主要分离于野鸟和家禽,且绝大多数鉴定毒株为无致病性毒株;class II型通常分离自家禽及其他多种禽类,其从无致病性、低致病性、中等致病性到高致病性毒株均有,并构成了连续的毒力谱。其中的强毒株常引发新城疫(Newcastle disease,ND)疫情,并造成严重的经济损失,已成为危害养禽业发展的主要病毒之一。Class II型NDV又可细分为16个基因型;当前,在世界范围内,所流行的ND以class II NDV中的基因VII型毒株为主,但近年来class I型NDV的分离率也在不断增加。NDV感染后引起机体各组织不同程度的病理反应及临床症状,反映了NDV致病能力的高低,然而,对产生该差异的原因,迄今尚未完全明确。巨噬细胞作为宿主天然免疫系统的重要组成部分,是一类重要的免疫效应细胞,其可通过极化分型并分泌细胞因子来调节炎症、抵御病原的感染。同时,巨噬细胞还能够表达多种Toll样受体(TLRs)以识别病原体相关分子模式(PAMP)从而启动宿主天然免疫应答,其中,TLR7是抵抗病毒感染过程中的关键分子。目前,关于鸡巨噬细胞的抗病毒功能研究还鲜有报道,鉴于此,本研究分别以class II型NDV强毒株、class II型NDV弱毒株及class I型NDV弱毒株感染鸡巨噬细胞(HD11),通过检测鸡巨噬细胞在不同感染时间点上病毒载量、极化标志基因和抗病毒因子的m RNA表达水平,以比较不同毒力NDV感染所致鸡巨噬细胞极化分型的差异与影响,并在此基础上,进一步探讨了激活的TLR7对NDV强弱毒感染后鸡巨噬细胞中病毒载量、极化分型及其抗病毒感染的作用机制,旨在阐明不同毒力NDV感染所引起的病理反应差异的原因,为抗感染免疫调节剂的筛选和研发提供确凿依据。本研究主要内容如下:1.NDV强、弱毒株感染对鸡巨噬细胞极化分型的影响本研究首先以本实验室分离、鉴定及保存的class I型NDV F55株为参考毒株,成功建立了针对class I型NDV的实时荧光定量PCR检测方法。之后,选取2株不同毒力的NDV毒株(class II基因VII型强毒株NA-1、class II基因II型弱毒株La Sota)以及1株class I型弱毒株F55分别感染鸡巨噬细胞(HD11),采用实时荧光定量PCR技术,对HD11细胞感染后不同时间点上的感染毒株的病毒载量进行测定。结果显示:在感染后至24 h期间,三个实验毒株在HD11细胞中都呈现出病毒载量持续上升;感染后24~72 h期间,强毒株在HD11细胞中的病毒载量仍呈现出持续上升状态,而两株弱毒株的载量却一直保持着相对稳定的状态,且在感染24 h之后,二者的载量与强毒株相比呈现出越来越显著差异状态。为阐明产生这一现象的原因,本研究进一步对HD11细胞内M1型、M2型巨噬细胞极化标志基因、TLR7及I型干扰素(IFN-α、β)的m RNA水平进行了测定。结果表明,强毒株感染后,HD11细胞呈现出剧烈的M1型及M2型混合极化特征,产生大量IFN-α、IFN-β,进而抑制了TLR7表达;而弱毒株感染后,仅呈现出轻微的单一极化型特征及I型干扰素变化,因而尚不足以明显影响TLR7的m RNA水平。此外,为进一步探究病毒的复制及其核酸对鸡巨噬细胞的影响,本研究还采用紫外照射2 h的方法对病毒进行灭活处理,并以此灭活病毒接种HD11细胞后再作检测。实验结果表明:HD11细胞在用紫外灭活的class I型弱毒株刺激后,其M1和M2的标志基因水平均较对照组有显著上调,并呈现出了与强毒株感染后相似的变化与变化趋势;而同样灭活后的强毒株和class II型弱毒株则并无明显影响。由此推测,class I型NDV可能具有某种尚未知的作用机制,此有待于今后的进一步探究。2.TLR7对NDV感染后鸡巨噬细胞功能作用的影响及其抗病毒机制的研究为进一步探究TLR7在NDV感染鸡巨噬细胞中的作用,本研究预先用TLR7特异性配体Loxoribine激活HD11细胞内的TLR7,然后再用NDV感染TLR7激活后的HD11细胞。实验结果表明,TLR7的激活能够显著降低NDV强毒株感染后HD11细胞内病毒载量,抑制了HD11细胞M1、M2混合极化趋势,并降低细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量;而TLR7的激活仅使class II型弱毒株感染后的HD11细胞呈现出轻微的M1/M2混合极化状态,抑制了病毒的复制,但对class I型弱毒株感染后的HD11细胞则并无明显影响。这些结果表明:TLR7激活后,可以抑制强毒NDV在HD11细胞内的复制,减轻了强毒NDV感染所致的“细胞因子风暴”,进而缓解其所致的细胞损伤。