论文部分内容阅读
新城疫是世界公认的最重要的禽类传染病之一,是由新城疫病毒引起的高度接触性、传染性疫病,可导致禽类的大量死亡或生产性能的急剧下降,给世界养禽业造成巨大的经济损失。本研究针对新城疫病毒检测方法中存在的问题,运用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心原理,建立了新城疫病毒的快速检测方法。本研究首先以纯化的小鼠IgG免疫兔,制备兔抗鼠血清,并用饱和硫酸铵盐析法提纯兔抗鼠IgG;然后以Protein G亲和层析法纯化两株抗新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)单克隆抗体(抗NDV-F 6C4单抗、抗NDV-F 4D9单抗),提纯前后的抗体用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化效果。结果显示,纯化后的抗体杂蛋白含量少,纯度较高。采用柠檬酸三钠还原法,成功制备了30nm的胶体金,以透射电镜观察其质量,结果为直径为30nm的胶体金颗粒,大小均匀,呈分散状态的椭圆形。以制备好的胶体金进行标记条件摸索,成功确立了单克隆抗体的胶体金标记条件:最适pH值是8.7,抗体的最佳结合量为6.6μg/ml,并制备了金标记的NDV-F 6C4单克隆抗体。以胶体金标记的抗NDV-F 6C4单克隆抗体制备免疫金垫,吸附于玻璃纤维:以抗NDV-F 4D9单克隆抗体和兔抗鼠IgG分别喷点于硝酸纤维素膜上,成为T线和C线,采用制备双抗体夹心法,制备成NDV免疫层析快速检测试纸条。经试验,胶体金标记抗体最适稀释度是1:2,以30ul/cm喷膜;T线为0.6ul/cm的单克隆抗体(3.0mg/ml),C线为0.6ul/cm兔抗鼠IgG高免血清(1.5mg/ml)条件下检测效果最佳。用试纸条检测新城疫病毒时,5min左右显示结果。通过特异性、敏感性、重复性和稳定性试验以及对实验感染鸡检测,证明该方法结果客观、准确,肉眼易于判断,且特异性强、重复性好、操作简便快速,是一项很有开发、推广应用前途的新技术,可用于新城疫的流行病学调查和田间监测。本试纸条的研制为新城疫的快速诊断提供了一种更加实用的方法。