疾病关联蛋白质的新型可视化检测方法研究

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蛋白质是人类生命活动的主要承担者,具有多种生理功能,某些蛋白质的异常表达能够反映人体内的多种疾病。因此,准确检测人体内疾病关联蛋白质对预防疾病具有重要意义。目前,传统蛋白质检测方法较为准确,但严重依赖大型仪器和专业操作人员,无法满足便捷检测的需求。基于纳米酶催化的可视化检测方法具有成本低廉、操作简单和灵敏度高等众多优势,在生化分析领域拥有广阔的发展潜力。因此,本研究构建了三种新型可视化检测方法对疾病关联蛋白质进行检测。主要研究内容如下:(1)基于Fe3+与2-磷酸抗坏血酸盐显色反应构建碱性磷酸酶可视化定量检测平台。本章研究发现Fe3+能够与无色底物2-磷酸抗坏血酸盐(AAP)特异性配位,形成棕色的Fe3+-AAP复合物,具有特定的紫外吸收峰(472 nm)。而当加入碱性磷酸酶(ALP)后,ALP能够水解AAP底物形成抗坏血酸(AA)和磷酸根离子(Pi),不能与Fe3+发生显色反应。基于这一原理,本章实现了对ALP的高灵敏度和高选择性比色检测,线性范围为0.8~80 U/L,检测限低至0.66 U/L,并成功应用于血清中ALP的定量检测。(2)基于Mn O2微球类氧化酶构建碱性磷酸酶可视化定量检测平台。本章通过引入纳米酶催化体系放大检测信号,提高了对ALP的检测灵敏度。首先,合成了具有良好类氧化酶活性的Mn O2微球,能够催化氧化无色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)形成蓝色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺氧化物(TMBox)。当加入ALP时,它能水解AAP生成AA,将Mn O2微球还原为Mn2+。此时,Mn2+不具有类氧化酶活性,不能催化TMB显色反应。基于该策略,能够实现了对ALP的高灵敏和高选择性比色检测,检测范围为0.5~120 U/L,检测限低至0.42 U/L,并成功应用于血清中ALP的定量检测。(3)基于Zr-MOF类过氧化物酶构建磷酸化蛋白质定量检测和区分比色传感阵列。本章引入了主成分分析法(PCA),实现了对多种疾病关联磷酸化蛋白质的区分。首先,制备了具有良好类过氧化物酶活性的Zr-MOF,其能够在H2O2存在下催化TMB显色反应。同时,Zr-MOF中Zr能够特异性识别蛋白质中磷酸基团。当加入磷酸化蛋白质时,磷酸化蛋白质能够绑定Zr-MOF,并抑制其类过氧化物酶活性。基于这一原理,实现了对α-酪蛋白(α-CS)高效定量检测,检测范围为0.17~0.5μg/m L,检测限低至0.16μg/m L。此外,本章还利用PCA,实现了磷酸化与非磷酸化蛋白质的准确区分。
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