植物在逆境胁迫下常常会因吸收不到足够的营养物质而不能维持正常的生理功能。低温、干旱、ABA、高盐等非生物胁迫是广泛影响作物生产和植物生长的不利生境。当植物处于某一胁迫环境中时,植物会调控自身含有的与胁迫相关的基因的表达,产生相应的适应性。目前已经克隆了许多胁迫相关基因,用于植物抗逆基因工程中,并得到了一些有一定抗逆性的转基因植株,展示了广阔的前景。程序性细胞死亡是指为维持内环境的稳定,由基因控制的细胞自主且有序性的死亡,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等,在真核生物发育、免疫调控和细胞稳态平衡方面发挥了重要作用,因而是具有生理性和选择性的。通常情况下,细胞死亡被分为细胞坏死和凋亡(PCD)。前者是因病理而产生的被动死亡,如由化学性或物理性的损害因子、缺氧或营养不良等条件引起的细胞坏死。后者是一种程序化的主动性细胞死亡,是通过依赖于caspases的蛋白家族定义的。但是大量研究结果表明还存在caspase非依赖性的细胞程序性死亡,已被人们初步认识的有自体吞噬作用等途径。自体吞噬是广泛存在于真核细胞中的一种溶酶体依赖性的降解途径,它能引起细胞中长寿命蛋白的降解,参与细胞的正常生长发育过程和维持代谢平衡。在某些压力条件下,如在损伤、营养匮乏、饥饿状态等情况下,可以循环利用细胞组分最终使细胞得以生存,甚至在某些组织的癌变过程中也扮演重要角色。自体吞噬作为广泛存在于真核细胞中的生命现象,贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程,对防止如神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命有积极作用。因此对细胞自噬作用和自噬型细胞死亡的研究不仅具有理论意义,而且也具有非常重要的应用价值。自噬基因的发现使我们从分子水平认识了自噬,但对自噬起源、信号转导及其对细胞生存影响的了解尚不全面。随着对自噬作用机制的深入研究,我们期望可以通过调控细胞的自噬水平,控制癌症及神经退行性疾病的发展,延缓衰老,提高生存质量。近年来由于分子生物学、基因组学等实验手段的日臻完善,尤其是酵母自噬突变株的产生,使得对自噬分子基础的研究有了很大的进展。ATG8编码的蛋白是自噬降解途径中的核心蛋白。通过化学合成或剔除ATG8能抑制自体吞噬[1],从而阻止ROS积累和细胞死亡。这揭示了自体吞噬在细胞死亡中有很重要的作用机制[1,2]。本实验采用RT-PCR方法,扩增得到ATG8e、ATG8f、ATG8h,利用植物表达载体pCAMBIA3301(分别携带CamV35S, rd29A, SEN1启动子)和农杆菌GV3101将其在拟南芥中过量表达。用除草剂筛选获得抗性苗,并进一步得到纯合系,然后对其进行了分子生物学的验证并在胁迫条件下观察表型。转基因植株的分子生物学检测如下:1.转基因植株均能通过PCR扩增出约500bp的Bar基因的特异性条带,表明所构建的载体已经整合到拟南芥基因组中。2.在所筛选到的rd29A-8f的纯合株系中,随机挑选三株(3-3-6,4-3-5,6-6-3)与野生型对照同时进行不同的胁迫处理(ABA、低温、高盐等),24h后取材,提取植株的RNA并进行RT-PCR。结果显示:从整体上看,处理后的转基因纯合系ATG8f的表达量与处理前相比有不同程度上升,而野生型处理前后ATG8f含量差别不大。说明了在这些胁迫条件下,rd29A启动子启动ATG基因的表达。同时,将纯合系与野生型植株同时置于不同的胁迫条件下,如:干旱、低温、ABA、NaCl,观察各种植株在不同处理条件下的表型。结果发现:(1)干旱、低温等胁迫条件下,自体吞噬发挥抗细胞死亡的作用,纯合系比野生型生长良好;(2)当它们用高盐处理时,自体吞噬发挥促细胞死亡的作用,纯合系不如野生型生长的好。这进一步说明了,自体吞噬与细胞程序性死亡之间的关系密切。