研究背景：　　microRNA(miRNA)是一类长度约22核苷酸的非编码单链RNA，在转录后水平调节基因的表达。研究表明，miRNA的异常表达与多种癌症相关，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，并且与肿瘤细胞的耐药性密切相关。吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），广泛应用于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的临床治疗并取得了良好的疗效，但频繁出现的耐药现象限制了其进一步的发展。本研究通过miRNA芯片技术，检测吉非替尼耐药的NSCLC细胞株与敏感株中miRNA表达的差异，筛选出与NSCLC耐药相关的miRNAs，初步探讨miRNA与NSCLC吉非替尼耐药的关系。　　研究方法:　　1．细胞培养　　用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。为保持PC9/GR的耐药性，该细胞需培养在含吉非替尼的2μmol/L的上述培养液中，于实验的前3d更换为无吉非替尼的上述培养液。细胞呈贴壁生长，3至5d传代1次，选择对数生长期的细胞实验。　　2．CCK8法测定PC9/GR对PC9的耐药倍数　　取对数生长期细胞消化，制备成单细胞悬液，PC9/GR以浓度2.5×104mL-1、PC9以2×104mL-1，接种于96孔板中（100μL/孔）。实验分为PC9/GR组和PC9组，每组分实验组和对照组。培养24h，分别加入终浓度为0.222、0.667、2、6、18、54μmol/L及0.0056、0.0167、0.05、0.15、0.45、1.35μmol/L的吉非替尼，终体积为200μL，每组浓度4个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养72h，弃去旧液，每孔CCK8与培养液以1:10比例加入，继续培养40min，用酶标仪测定各孔OD450值。采用CompuSyn软件计算吉非替尼的IC50值（半数抑制浓度），实验重复3次。　　3．总RNA的提取及质量检测　　Norgen Biotek试剂盒Total RNA Purification Kit提取总RNA。获得RNA样品用微量紫外分光光度计测定RNA在230、260和280nm波长的吸收值，得出RNA浓度并通过 A260/A280及 A260/A230的吸收比值判断 RNA纯度。采用Agilent2100分析仪检测RNA完整性。　　4．miRNA芯片检测及数据分析　　芯片由美国LC Sciences公司制作，含有最新版本探针序列（Sanger miRBase Ver.16.0），包括人类已经确定的1212个miRNA探针，每个探针重复3次。采用激光扫描仪采集杂交图象、Array-Pro软件对杂交图像进行数字化转换。数据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过 LOWESS过滤进行标准化。本实验为双色标记实验，计算两种检测信号的比值(log2)和t检验的p值，以P＜0.01定义显著差异性表达。　　5．荧光定量PCR检测miRNA表达　　将miRNA芯片分析结果中差异表达较显著且信号值较高的9个miRNAs进一步行荧光定量PCR分析。分别取2种细胞总RNA进行逆转录，以U6作为内参照。PCR反应程序：预变性95℃20s，1cycle；变性95℃10s,退火60℃20s,延伸70℃5s,40 cycle。反应体系：SYBR Green Mix（包括Taq酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR Green I）9μL，逆转录产物2μL、Forward Primer2μL、Reverse Primer2μL、加水至总体积为20μL。ABI7500 Real-time PCR仪进行检测，数据采用2－ΔΔCt法进行分析。　　6．miRNA mimics/inhibitor转染效率的检测　　将miRNA mimics（模拟物）及mimics NC（对照）以50nmol/L浓度转染至PC9/GR中，miRNA inhibitor（抑制剂）及inhibitor NC（对照）100nmol/L转染至PC9/GR中，24h之后提取其总RNA，荧光定量PCR检测实验组与对照组相比的miRNA表达量。　　7．CCK8法检测吉非替尼的敏感性　　取对数生长期PC9/GR细胞以浓度2.5×104mL-1接种于96孔板中，在各实验组中转染miRNA mimcs/inhibitor，对照组中转染mimcs/inhibitor NC，24h后加入4μmol/L、8μmol/L吉非替尼，作用72h后CCK8法（步骤同上）检测细胞存活，计算抑制率。　　8．统计学方法　　IC50值采用CompuSyn软件计算;各组间比较采用SPSS13.0进行单因素方差分析或t检验;检验水准α=0.01。　　研究结果：　　1．PC9及PC9/GR对吉非替尼的IC50值及耐药倍数　　CCK8结果显示，吉非替尼对PC9和PC9/GR细胞的增殖均有抑制作用。吉非替尼对PC9和PC9/GR细胞的IC50值分别为42.89nmol/L和3.87μmol/L，两者差异有统计学意义（P<0.01），耐药倍数为90.23倍。　　2．miRNA芯片样品总RNA的质量鉴定结果　　从PC9和PC9/GR中提取总RNA，用微量紫外分光光度计测量吸光值，结果显示A260/280分别为1.96和1.92，A260/230分别为2.22和2.31，表明所提取的总RNA纯度较高。Agilent2100分析仪检测结果显示28S和18S核糖体RNA亮而浓，28S/18S值PC9为2.0、PC9/GR为1.4，表明总RNA完整性好。质量检测结果表明，总RNA样品质量符合芯片要求。　　3．PC9和PC9/GR中miRNA表达谱差异　　通过对PC9和PC9/GR中miRNA表达谱数据进行分析，P＜0.01的miRNAs有55条，其中在耐药株PC9/GR中上调的有21条，包括miR-1246、miR-125b等；下调的有34条，包括miR-224、miR-125a-5p等。表达差异2倍以上的25条。　　4．荧光定量PCR验证芯片结果　　将 miRNA芯片结果中差异表达较显著且信号值较高的9条 miRNAs（miR-224、miR-125a-5p、let-7e、miR-99b、miR-762、miR-200b、miR-1246、miR-125b、miR-15a）进一步采用荧光定量PCR检测，其中8个miRNA芯片结果相符，仅miR-15a与芯片结果相反，提示miRNA芯片结果基本能正确反映PC9和PC9/GR细胞株中miRNA的表达差异。　　5．转染效率　　将50nmol/L miR-224 mimics及其NC对照转染至PC9/GR中，mimics组中miR-224的表达量相对与NC对照组提高了约1502倍；将100nmol/L miR-1246 inhibitor及其NC对照转染至PC9/GR中，inhibitor组中miR-1246的表达量相对与NC对照组减少了约68%。　　6．CCK8法检测吉非替尼的敏感性　　进一步将miR-224、miR-125a-5p、let-7e、miR-99b、miR-762、miR-200b、NC mimics及miR-1246、miR-125b、NC inhibitor转染至PC9/GR中，予4μmol/L、8μmol/L吉非替尼作用，72h后 CCK法检测细胞存活，观察 miRNA对吉非替尼敏感性的影响。　　在4μmol/L吉非替尼中，miR-125a-5p mimics组的抑制率相对于对照组降低30.55%，P＜0.01；在8μmol/L吉非替尼中，miR-125a-5p mimics组的抑制率相对于对照组降低33.03%，P＜0.01。　　结论：　　1．非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞株和敏感细胞株miRNA表达差异显著。　　2． miRNA芯片是筛选差异表达miRNA的有效工具。　　3．转染miRNA mimics/inhibitor可以调控细胞中目的miRNA的表达水平。　　4．过表达 miR-125a-5p促进吉非替尼耐药，miR-125a-5p可能与吉非替尼耐药相关。