论文部分内容阅读
目的:日光中的紫外线(UV)是造成机体DNA损伤的常见因素。正常细胞DNA损伤后会启动DNA损伤修复系统对损伤进行修复,如果损伤能够及时修复,细胞内的DNA结构恢复,继续正常复制。如果损伤不能够修复,细胞有可能会走向凋亡、衰老、突变甚至癌变。RAD6B是一种泛素交联酶E2,在DNA损伤修复及染色质结构和基因表达调控中发挥重要作用。本研究探讨RAD6B在UV诱导的DNA损伤修复中的作用。方法:培养收获处于对数生长期的293T细胞,利用CRISPR/Cas9技术构建RAD6B基因敲除细胞,免疫印迹实验验证RAD6B敲除效果。通过UV诱导DNA损伤。将实验分为四组:sgCON(阴性对照)、sgCON-UV(阴性对照+UV照射)、sgRAD6B(RAD6B敲除)、sgRAD6B-UV(RAD6B敲除+UV照射)。通过免疫荧光观察RAD6B在UV诱导的DNA损伤修复通路中的位置,Western Blotting观察损伤因子响应情况并探索RAD6B的底物,CCK8研究RAD6B敲除细胞对UV的敏感性,Hoechst染色从形态学观察细胞的凋亡。结果:1.免疫印迹实验结果显示,与阴性对照相比,感染LV-UBE2B-sgRNA(00485-1)病毒组细胞RAD6B表达明显降低(P<0.01)。2.免疫荧光染色发现UV照射后XPC和γH2AX在细胞核内被招募。通过免疫印迹观察不同剂量和时间点γH2AX的表达,发现随着UV剂量增加,γH2AX表达增加,说明随着剂量加大细胞损伤程度也在增加,但UV剂量为15 J/m~2时,γH2AX表达最高。UV(15 J/m~2)照射后随着时间推移,γH2AX也在逐渐增加,2 h时间点γH2AX表达最高。通过免疫荧光检测sgCON和sgRAD6B两组细胞在UV照射后不同时间点CPD的表达,结果显示,两组细胞在UV照射后15 min均出现CPD募集,但与阴性对照细胞相比,RAD6B缺陷细胞在UV照射后18 h仍能检测到CPD表达。3.免疫荧光染色观察到MDC1、BRCA1、53BP1与损伤标记γH2AX在细胞核内共定位。免疫印迹结果显示,RAD6B敲除前后γH2AX与ERCC1在UV照射后均响应,并观察到ERCC1由胞质进入胞核修复损伤。随后我们采用免疫荧光技术检测细胞核内BRCA1和53BP1的表达,发现与对照组相比,RAD6B缺陷的细胞核中BRCA1和53BP1的foci形成明显减少(P<0.01)。4.UV照射后,对照组细胞H2A的泛素化水平增加(P<0.01),RAD6B缺陷细胞H2A泛素化水平下降(P<0.05)。H2B在UV照射后出现了去泛素化(P<0.01),但与对照组相比,RAD6B缺陷细胞H2B的泛素化没有明显差异。5.CCK8结果显示,敲除RAD6B降低了细胞存活。Hoechst染色结果显示,与对照组相比,RAD6B缺陷的细胞经UV处理后凋亡细胞增多。结论:1.RAD6B参与UV诱导的DNA损伤修复。2.UV诱导的DNA损伤修复通路中,γH2AX、ERCC1在RAD6B上游,募集RAD6B到DNA损伤部位,招募下游DNA损伤修复因子BRCA1和53BP1。3.在UV诱导的DNA损伤修复中,RAD6B可能通过泛素化组蛋白H2A、H2B以及H1.2参与损伤修复。4.RAD6B缺陷细胞对UV更加敏感,并且增加了UV诱导的凋亡发生。