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牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）可以感染牛和羊并引起急性传染性腹泻。近年研究显示,BVDV也可能感染猪,在猪群中BVDV血清抗体阳性率较高。由于BVDV与猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）基因组及其编码蛋白结构相似,而且BVDV本身存在基因1型或2型。因此,猪群中若存在CSFV野毒感染或疫苗免疫抗体,同时又有BVDV1型或2型的潜在感染,需要有一种合适的抗体检测方法,以区分是何种病毒感染产生的抗体。此外我国部分地区存在较高BVDV的血清阳性率,但浙江地区猪群中BVDV血清阳性率未知。因此,本研究的主要目标是:1)采用体外原核表达技术制备针对BVDV1和BVDV2的Erns和E2特定抗原区的重组蛋白,构建并优化BVDV血清抗体的间接ELISA（iELISA）检测体系;2)利用构建成功的BVDV1-iELISA检测体系分析浙江部分地区猪血清样品中BVDV1抗体阳性率。1.牛病毒性腹泻病毒1型和2型Erns和E2原核表达蛋白制备通过对BVDV1和BVDV2的Erns和E2抗原区域分析,利用分子克隆技术构建以p ET-30a（+）为载体的携带BVDV1和BVDV2不同抗原片段的重组质粒,将其转入Rosetta感受态细胞后,通过IPTG诱导,获得原核表达的BVDV1-Erns-R、BVDV1-E2、BVDV2-Erns-R和BVDV2-E2蛋白。经SDS-PAGE电泳验证,所有原核表达产物均成功表达及纯化,为后续构建间接ELISA体系奠定基础。2.猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA体系优化通过比较BVDV1型和2型的Erns及E2抗原区与已知猪瘟阳性血清的交叉反应性,发现部分蛋白片段通过优化后与CSFV血清抗体的交叉反应性显著下降。继续对间接ELISA体系进行优化,但发现BVDV2的Erns及E2抗原与BVDV1血清有显著交叉反应性。因此,本研究首先构建和优化了BVDV1-i ELISA方法。确定Erns及E2抗原包被浓度为5μg/m L,抗原包被条件为4℃,过夜,封闭液为0.1%casein溶液,猪血清和酶标二抗分别以1:200和1:10000倍稀释（均37℃孵育1 h）。该i ELISA方法批内变异系数为2.86%-6.86%,批间变异系数为2%-4.13%。Erns-R和E2分别对31份阴性猪血清的平均OD值与3倍标准差之和为0.39与0.49,确定的阳性阈值为0.40与0.50。用商品化BVDV1 ELISA试剂盒对390份血清进行平行比对分析,Erns和E2双阳性作为BVDV1的血清阳性判断标准,该体系的敏感性和特异性分别为94.3%和88.3%,Kappa值为0.83。以Erns或E2分别作为BVDV1的血清阳性判断标准,体系的敏感性分别为94.8%和94.3%,特异性分别为87.2%和87.8%,Kappa值均为0.82。说明Erns和E2可以单独或共同作为包被抗原建立i ELISA,并用于检测猪血清中BVDV1抗体的阳性率。3.浙江省部分猪场牛病毒性腹泻病毒1型抗体的血清学调查用上述BVDV1-i ELISA体系,对本实验室采集和省农业科学院畜牧兽医研究所提供的浙江省部分猪场的1246份猪血清样品进行了检测。结果表明,猪血清中BVDV1-Erns的抗体阳性率为57.1%,BVDV1-E2的抗体阳性率为50.6%,Erns和E2双阳性率为44.8%。2017-2019年间,BVDV1抗体阳性率呈逐年递增趋势。各地区BVDV1抗体阳性率为39.7%-62.0%,地区差异性较大。综上所述,本研究建立的猪血清中BVDV1型抗体检测间接ELISA方法可作为试剂盒进行开发;浙江省部分地区猪群中BVDV1的血清阳性率较高,对这一趋势应当进行系统分析和病原学检测（核酸检测或病原分离）,以明确BVDV1抗体阳性是否是野毒感染所致还是疫苗中使用的牛血清污染有BVDV1型病毒引起。