炎症（inflammation）是感染、非感染等多种损伤性刺激作用于机体,活化固有免疫系统的一种防御性反应,局部表现为红、肿、热、痛和功能障碍[1-3]。炎症是一把双刃剑,适度的炎症对机体是一种有效的防御措施,能起到杀灭病原微生物,限制病原体扩散的作用,但过度的炎症反应则会导致细胞因子等大量炎症介质释放入血,造成炎症失控,从而带来全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,甚至多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）,危及患者生命[2～4]。炎症的防御性反应最重要的功能是将白细胞送到感染灶,所以白细胞渗出迁移是炎症反应最重要的特征。细胞迁移（cell migration）指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。其中最重要的信号分子就是趋化因子（chemokine）[5.6]。趋化因子,也称为趋化激素、趋化素或者化学激素,是一类小分子细胞因子家族蛋白。趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移,细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子的源头处迁移。其中,炎性趋化因子的主要作用就是趋化白细胞（如单核细胞和中性粒细胞）从血循环到或组织损伤部位。趋化因子拥有保守的氨基酸,对其创造自己的三维或三级结构尤为重要,在大多数情况下,四个半胱氨酸残基形成两对双硫键以构成趋化因子的特殊结构。根据其分子结构中氨基酸区域上半胱氨酸残基的数量及空间排列不同,趋化因子可以分为:CC类趋化因子,如CCL1、CCL2等;CXC类趋化因子,如CXCL1、CXCL2等;C类趋化因子,如XCL1、XCL2;CX3C类趋化因子,如CX3C1。趋化因子的受体是G蛋白偶联受体[5,6]。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）,是一大类膜蛋白受体的统称。此类受体的共同点是:其立体结构中都有7个跨膜α螺旋,且其肽链的C端和连接第5和第6个跨膜螺旋的胞内环上都有G蛋白（鸟甘酸结合蛋白）的结合位点[7]。根据受体结合的趋化因子种类不同将受体称为CXCR1-CXCR5（结合于CXC上）;CCR1-CCR9（结合于CC上）;XCR1（结合于C上）及CX3CR（结合于CX3C上）。与配体结合的G蛋白偶连受体会发生构象变化,从而表现出鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）的特性,通过以三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate,GTP）交换G蛋白上本来结合着的二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate,GDP）使G蛋白的α亚基与β、γ亚基分离,这一过程使得G蛋白变为激活状态,并参与下一步的信号传递过程,产生不同的生物学效应。生物系统受到外界某个特异刺激持续作用后,所产生的效应会逐渐减弱,这个过程往往被称之为脱敏或去敏化（desensitization）[14,15]。受体的快速去敏化则是由于受体磷酸化引起的,其中,G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptors kinases,GRKs）起关键作用[8]。GRKs是一种丝氨酸-苏氨酸激酶,其GRKs家族有七个成员,其中GRK1和GRK7主要分布在视网膜上,介导光感传导;GRK4仅在睾丸高水平表达;GRK2、GRK3、GRK5和GRK6则在全身各个组织均有表达。GRK2在调节白细胞功能方面发挥重要作用[9,10]。GRKs对GPCR的调节是通过自身活性的调节实现的,而GRKs活性的调节包括三个机制:自身激酶活性的改变,亚细胞定位,GRKs自身表达水平的改变。GRK2在调节白细胞功能方面发挥重要作用,所以我们关注的是GRK2自身活性的调节[11,12]。在感染过程中,炎症病灶部位不可能仅存在单一一种趋化因子,必定还存在多种炎症介质,如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）家族、白介素家族（interleukin）、干扰素（interferon）以及病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）,如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、肽聚糖（peptidoglycan）、脂蛋白（lipoprotein）等都有可能启动炎症信号转导过程（13-15）。LPS是内毒素的主要成分,来源于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜,在污染的空气、职业性粉尘、香烟中到处都有LPS,吸入一定浓度的LPS后即可引起或加重一系列临床病症。LPS是Toll样受体家族成员TLR4的特异性配体,可以诱导一系列炎症反应,包括炎症介质的产生,自身免疫细胞迁移的诱导[16,21]。单核细胞是先天性免疫系统重要的效应细胞,通过迁移到炎症部位,分化为巨噬细胞或树突状细胞,引起免疫反应,杀死病原微生物,从而达到保护机体的作用。单核细胞的迁移由趋化因子激发,通过趋化因子受体,受信号机制调节,沿着浓度梯度发生迁移[7,8]。单核细胞迁移所需的趋化因子是单核细胞趋化因子 1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）。MCP-1,也被称为 CCL2,是一种分子量为13 kDa的趋化因子,在单核细胞的激活和迁移过程中发挥重要作用[10,17]。MCP-1可以由造血细胞和非造血细胞分泌,包括单核/巨噬细胞,树突状细胞,星形胶质细胞,内皮细胞以及成纤维细胞[18]。在感染和炎症过程中,MCP-1可以诱导单核细胞向局部炎症感染部位迁移。MCP-1通过与CCR2受体结合而发挥生理学效应,CCR2是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）家族成员[19,20]。关于趋化因子对炎性细胞迁移的调节,尤其是MCP-1对单核细胞的调节,已经有很多的报道。但是由于炎症反应不可能是由单一一种刺激因子产生的结果,所以我们更感兴趣的是两种或更多的刺激同时存在时,细胞迁移是否会发生改变以及其背后潜在的机制。曾有报道指出,LPS可以通过改变GRK2和GRK5的表达量进而对中性粒细胞的迁移产生影响,提出了LPS-TLR4信号通路与MIP2-CXCR2信号通路交互作用（cross-talk）的新模型[21]。然而,关于LPS-TLR4信号通路与MCP-1诱导的单核细胞的迁移的关系至今仍然不是很清楚。因此,我们首先通过体内外实验证实了 LPS确实对MCP-1诱导的单核细胞的迁移有影响,然后利用流式细胞学分析技术、RNA干扰技术、Western blotting技术等从细胞膜受体开始逐步深入,直到细胞内检测到激酶GRK2的变化,从而阐明了 LPS-TLR4信号通路与MCP-1-CCR2信号通路在调节单核细胞迁移过程中的交互作用。我们分离并培养C57BL/6野生型小鼠和TLR4基因敲除小鼠的骨髓来源的单核细胞,利用体内体外实验发现LPS-TLR4信号通路可以增强由MCP-1诱导的单核细胞迁移到炎症部位的数量强度的增加。接下来,我们利用流式细胞学技术,RNA干扰技术以及Western blot技术,对这一现象后潜在的生物学机制进行了深入的研究分析。通过研究,我们证实了:（1）LPS-TLR4信号通路增强由MCP-1诱导的单核细胞迁移的增加。我们利用Boyden小室分析技术,证实了当MCP-1的浓度在0～20 ng/ml的范围时,可以以剂量依赖性的方式诱导单核细胞的迁移增加,而当MCP-1的浓度达到200 ng/ml后,单核细胞的迁移反而减少,这可能是由于高浓度的趋化因子引起受体的快速去极化。我们同时发现单独的LPS刺激未能引起单核细胞的迁移,但是LPS却可以增强由MCP-1诱导的单核细胞的迁移,我们利用TLR4基因敲除小鼠的骨髓培养的单核细胞进行该实验,发现该效应消失,说明LPS是通过TLR4受体发挥效应的。我们通过体内试验也证实了这一现象。（2）LPS-TLR4信号通路通过调节细胞表面CCR2受体的表达增强由MCP-1诱导的单核细胞的迁移。受体一旦被刺激物激活,就会快速发生削减反应,我们称之为去敏化,通过这种负反馈调节,从而避免受体的急慢性反应过度。而受体的内化则是去敏化反应的一个主要机制。已经有大量报道证实:在单核细胞中,MCP-1可以诱导CCR2发生内化。为了证实LPS是否对这一过程有影响,我们利用流式细胞学技术在LPS刺激或不刺激的情况下,观察MCP-1诱导的CCR2表达的变化,结果我们发现,在单核细胞中,MCP-1可以时间依赖性的方式导致细胞表面CCR2表达下降,即发生内化,而LPS可抑制这一过程。同样利用基因敲除小鼠我们证实了 LPS是通过TLR4发生该效应的。（3）GRK2是参与由MCP-1诱导的CCR2内化的关键分子。已有报道证实:GRK2可以使CCR2发生磷酸化,从而使其发生内化。为了证实GRK2是否在MCP-1诱导的单核细胞表面CCR2的内化过程中发挥作用,我们利用RNA干扰技术使GRK2的表达下降85%,然后通过检测在不同刺激条件下,细胞表面CCR2的表达以及细胞的迁移情况,我们发现:MCP-1可以显著引起细胞表面CCR2表达下降,而GRK2被干扰掉后,这一现象得到明显逆转,从而进一步增强了单核细胞的迁移。这些现象均证实了 GRK2在MCP-1诱导的单核细胞迁移过程中发挥重要作用。（4）LPS可使GRK2的670位丝氨酸（serine 670,Ser670）发生磷酸化,从而抑制GRK2向细胞膜移位。已有报道证实:细胞一旦受到MCP-1刺激,GRK2就会由细胞浆向细胞膜发生移位,与CCR2接触后,使其发生磷酸化,进而发生内化。我们的研究发现,在单核细胞中,MCP-1刺激可以引起GRK2由细胞浆向细胞膜发生移位,而LPS同时刺激可抑制该效应。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）据报道可以调节 GRK2 的活性,而且证实细胞外调节蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1,ERK1）可以使GRK2的Ser670发生磷酸化,而该位点可以减弱GRK2-Gβγ的相互作用,从而抑制GRK2的膜移位,最终抑制GRK2对膜表面GPCR的调节。为了证实LPS-TLR4信号通路是否是通过对GRK2的调节从而达到干预MCP-1诱导的单核细胞的迁移,我们利用Western blot技术检测在不同刺激条件下,单核细胞GRK2的磷酸化情况以及细胞浆和细胞膜上GRK2的表达情况,结果我们发现:单纯的MCP-1不能引起GRK2发生磷酸化,而单纯的LPS即可引起GRK2的Ser670发生磷酸化。同时,我们还发现:MCP-1可以导致GRK2由细胞浆向细胞膜发生移位,而在LPS同时刺激情况下,这一现象可被明显减弱。因此,我们得出结论:LPS可使GRK2的Ser670发生磷酸化,从而抑制GRK2向细胞膜移位。（5）p3 8 和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）在由LPS和MCP-1诱导的单核细胞迁移过程中发挥相反的作用。MAPKs家族主要包括 c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase,JNK）、ERK 和 p38,是细胞迁移过程中重要的调节激酶。已有报道证实p38参与MCP-1诱导的单核细胞迁移过程。但是在我们所研究的LPS与MCP-1的相互作用中,MAPKs是否发挥作用,至今没有报道。因此,我们利用三种激酶特异性的抑制剂去除其活性,通过细胞迁移实验,流式细胞学技术,Western blot技术检测不同刺激情况下,细胞移动,GRK2的磷酸化情况以及细胞浆和细胞膜上GRK2的表达情况,结果我们发现:LPS通过p38可以诱导GRK2发生磷酸化,抑制GRK2由细胞浆向细胞膜的移位,导致细胞膜表面CCR2表达增加,细胞迁移增强。而ERK则表现出相反的效应。我们的研究提出一个新的信号通路模型:在单核细胞中,TLR4信号通路和CCR2信号通路存在交互作用,其两者的相互作用导致由MCP-1诱导的单核细胞的迁移显著增强。LPS激活TLR4信号通路,通过p38使GRK2的Ser670发生磷酸化,抑制GRK2向细胞膜发生移位,从而抑制CCR2的内化和去敏化,最终导致MCP-1诱导的单核细胞的迁移增强。我们的研究首次提出了 TLR4信号通路在自身免疫反应中的新功能,通过调节细胞表面趋化因子受体的表达从而控制炎症细胞向感染部位的迁移。同时对GRK2功能的新发现可以为临床感染过程中控制炎症提供新的治疗策略。