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研究背景与目的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是心血管疾病的独立危险因素,间歇低氧(Intermittent hypoxia,IH)所致内皮细胞损伤是OSAHS合并心血管疾病的始动环节。在间歇低氧所致损伤中,线粒体起关键作用,其参与细胞氧化应激发生及细胞凋亡等。本研究应用间歇低氧(IH)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察IH致线粒体损伤及凋亡蛋白变化,探讨IH致血管内皮损伤的线粒体相关凋亡通路,为进一步研究OSAHS相关心血管疾病机制奠定基础。方法1.实验设立IH组和对照组,IH组HUVECs予以1%O2 5min与21%O2 5min交替处理,分别进行8小时、16小时与24小时IH处理,对照组细胞予以常氧处理。2.应用流式细胞术检测细胞早期凋亡率,ELISA法检测白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、内皮素-1(ET-1)与可溶性细胞间黏附分子-1(s ICAM-1)水平,同时检测上清一氧化氮(NO)含量;分析早期凋亡率与炎症因子水平之间的相关性。3.差速离心法分离细胞的胞浆与线粒体,Western blot分别检测胞浆与线粒体中细胞色素c(cyt C)的表达水平。分析cyt C释放与炎症因子之间的相关性。4.透射电镜技术观察细胞线粒体超微结构变化,定量检测并比较两组内皮细胞的线粒体横径。结果1.IH组HUVECs不同时间点(8、16、24小时)的细胞早期凋亡率分别为(6.70±0.60)%、(8.86±1.19)%、(9.61±1.27)%,均显著高于对照组细胞早期凋亡率(2.45±0.80)%;且早期凋亡率随IH处理时间延长而增加(p<0.05)。2.上清中炎症因子IL-6浓度可随IH处理时间的延长而明显上升(50.37±2.85 pg/ml vs.100.50±7.12 pg/ml vs.186.10±12.14 pg/ml,p<0.01),24小时IH组上清中IL-6含量显著高于对照组(186.10±12.14 pg/ml vs.146.70±1.07 pg/ml,p=0.03)。IH组ET-1浓度呈现显著时间依赖性(16.43±0.04 pg/ml vs.17.60±0.18 pg/ml vs.22.43±1.00 pg/ml,p<0.01)。细胞上清IL-1β与s ICAM-1含量各组间均无明显差异,但呈现时间依赖性上升趋势(IL-1β:5.37±0.52 pg/ml vs.6.036±0.64 pg/ml vs.6.184±0.57 pg/ml;s ICAM-1:0.060±0.003 ng/ml vs.0.066±0.007 ng/ml vs.0.089±0.009 ng/ml,p值均>0.05)。24小时IH组NO含量较对照组显著下降(70.42±8.26μmol/L vs.42.72±4.36μmol/L,p=0.02),16小时IH组NO含量较8小时IH组也显著降低(29.75±4.43μmol/L vs.68.99±0.64μmol/L,p=0.01)。上述炎症因子与相对应3个IH时间点的细胞凋亡率进行相关性分析,结果显示IL-6、IL-1β、ET-1、s ICAM-1这4个炎症指标与早期凋亡率之间均存在相关性,相关系数分别为0.6895,0.9036,0.6694与0.8187(p值均<0.05)。3.HUVECs经IH(8小时、16小时及24小时)处理后,胞浆cyt C含量随IH时间延长而显著上升(p<0.05),同时线粒体cyt C含量呈下降趋势(p>0.05)。胞浆cyt C含量与早期细胞凋亡率之间存在显著相关性(r=0.9876,p=0.0124);而线粒体cyt C含量与凋亡率之间不存在相关性。进一步分析线粒体/胞浆cyt C含量与上清炎症指标的相关性,发现胞浆cyt C含量与IL-1β含量呈显著正相关(r=0.7377,p=0.0233)。4.HUVECs分别经16小时常氧与IH处理后,发现IH组内皮细胞的线粒体横径较对照组显著增大(0.2658±0.0059μm vs.0.2485±0.0046μm,p=0.0250),个别还出现嵴断裂、空泡化、膜破裂等现象,而对照组线粒体超微结构基本完整。结论1.IH致HUVECs细胞早期凋亡率增高具有时间依赖性,且与上清液IL-6、IL-1β、ET-1、s ICAM-1水平增高相关。2.IH致HUVECs胞浆/线粒体cyt C含量变化呈时间依赖性,胞浆cyt C含量与细胞早期凋亡率、上清IL-1β水平相关。3.IH致HUVECS细胞线粒体超微结构受损,可促进cyt C释放入胞浆,参与间歇低氧致HUVECs线粒体凋亡通路,导致血管损伤。