前言与背景国内外大量的双生子研究、寄养子研究证实,精神分裂症(Schizophrenia)具有非常明显的遗传倾向,是一种典型的多基因遗传病。Cannon等人在芬兰人群中的研究显示,精神分裂症的遗传度(heritability)高达83%,国内王为民等人在中国汉族人中进行的调查得到精神分裂症的遗传度为70.85%。说明精神分裂症的易患性中遗传基础所起的作用超过70%,而环境因素所起的作用不足30%。通过复合分离分析,连锁分析,受累同胞对分析,基于单核苷酸多态性(SNP)的关联分析以及全基因组关联分析(GWAS)等研究方法的应用,大量的精神分裂症易感位点(lq21-22、6p22-24、8p21-22、13q14-32等)和易感基因(DISC1、 COMT、BDNF、PLXNA2、CSF2R、PCM1、ZNF804A、RELN等)被发现。精神分裂症断裂基因1(DISCI)是目前较明确的精神分裂症易感基因之一,其首次在一个具有染色体平衡易位的苏格兰精神疾病高发家系中被发现,后续的深入研究显示DISCI与精神分裂症存在显著的相关性。酵母双杂交分析显示,DISCI蛋白是一个脚手架蛋白(scaffold protein),可与多种中枢神经系统的关键蛋白(PDE4B, GSK-3β,FEZ1, NDEL1, PCM1, GRB2, NDE1, ATF5, YWHAE等)发生相互作用。DISC1蛋白和大量与其相互作用的蛋白质共同组成的相互作用组(interactome)被称为DISC1通路(DISC1 pathway)。Bradshaw等人的研究显示,DISCI与DISCI通路中多种DISCI相互作用蛋白质是精神分裂症等多种精神疾病的可能分子发生机制。NDEL1和PCM1作为两种重要的DISCI通路蛋白,其与精神分裂症的相关性也得到国内外大量研究的证实。Lipska等对精神分裂症患者尸检结果显示精神分裂症患者海马和背外侧前额叶皮层中NDEL1的表达较正常对照显著降低。Tomppo等在芬兰人群中进行的病例对照研究发现NDEL1基因中一个SNP位点rs17806986与精神分裂症显著相关。同年,Ikeda等在日本人群中的研究发现NDEL1基因的两个SNP:rs3744652、rs8064655与精神分裂症不相关。最新的研究发现,精神分裂症患者血浆NDEL1寡肽酶活性显著低于健康人群,提示血浆NDEL1寡肽酶活性有可能成为精神分裂症的生物标志物用于其辅助诊断。Datta等发现,英格兰人群中PCM1基因中的SNP位点rs208747、rs445422、rsl3276297、rs370429与精神分裂症显著相关。而Hashimoto等在日本人群的研究表明rs445422、rs3780103、rs3214087、rs370429的基因型频率及等位基因频率在精神分裂症和正常对照间无显著性差异。上述文献显示,NDEL1基因和PCM1基因与精神分裂症在欧洲人群中存在关联,但这种关联并未在中国汉族人群中进行重复研究,而且两个基因与精神分裂症的关联在日本人群中均未得到重复,究其原因有三种可能：首先,真的假阳性关联正确的没有被重复；其次,真的关联在后续检验效能较低的重复研究中没有被重复；最后,真的关联在其研究人群中存在,由于复杂疾病的遗传异质性,在不同人群中进行的重复研究未能重复此关联。重复研究是确保发现与疾病真关联的必要保证,为了进一步阐明NDEL1基因、PCM1基因与精神分裂症之间的相关性特别是其与中国汉族人精神分裂症的相关性,本研究首次使用病例对照研究对中国南方汉族人群NDEL1基因和PCM1基因多态性与精神分裂症相关性进行研究。目的1在中国南方汉族人中重复和验证NDEL1基因rs17806986位点以及PCM1基因rsl3276297, rs208747位点多态性与精神分裂症的相关性；2探讨NDEL1、PCM1基因多个标签SNP位点多态性与精神分裂症的相关性,进一步阐明中国南方汉族人中NDEL1基因和PCMl基因多态性与精神分裂症的相关性；3探讨与精神分裂症相关联的SNP位点多态性与精神分裂症患者的首次发病年龄、住院次数、有无家族史、精神分裂症临床分型等临床特征的相关性,比较不同基因型上述临床特征间是否存在统计学差异。对象和方法1随机选择2013年6月-2014年6月期间在深圳市康宁医院急性干预科男病区,急性干预科女病区,普通精神科男病区,普通精神科女病区住院的精神分裂症患者100例,其中男性53例,女性47例,平均年龄32.72±10.14岁。随机选择2014年5月-2014年6月期间在深圳市龙岗中心医院体检科进行健康体检的健康体检者50名作为正常对照组,其中男性28名,女性22名,平均年龄32.24±8.73岁。病例组要求：由两名主治职称或以上的精神科医生依据DSM-Ⅳ做出精神分裂症的诊断；患者的生物学父亲、母亲均为汉族人：患者年龄要求18-60岁,男女性别不做限制；患者本人或者患者家属或其他法定监护人对本研究内容和性质充分了解并签署了知情同意书。排除心境障碍、精神发育迟缓、分裂情感性精神障碍等其他认知障碍及有严重躯体疾病者。正常对照组要求：受试者生物学父亲、母亲均为汉族人；受试者年龄要求18-60岁,男女性别不做限制：性别、年龄等一般人口学资料与病例组匹配；受试者与病例组无亲缘关系；受试者对本研究内容和性质充分了解并签署了知情同意书。排除具有神经精神疾病史,具有精神分裂症家族史或患有严重的躯体疾病或精神系统疾病者。2基因多态性检测(1)标签SNP选择：在国际人类基因组单倍型图计划网站(http://hapmap.ncbi. nlm.nih.gov/)检索NDEL1基因和PCM1基因内部及上游和下游各lOkb的中国北京汉族人群(CHB)的基因型数据包(Release28, Phase Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)。使用Haploview 4.2软件分别对下载的NDEL1基因和PCM1基因SNP数据包进行分析并筛选出标签SNP (TagSNP)。(2)基因组DNA的制备：每一个研究对象使用EDTA-2K真空采血管经肘静脉采集静脉血3ml,轻轻上下颠倒混匀。使用北京百泰克生物技术有限公司的全血基因组DNA快速提取试剂盒(溶液型)提取样本中所含的基因组DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取DNA纯度,使用核酸蛋白分析仪测定所提取DNA样本的浓度和纯度。(3)基因型检测：使用Sequenom公司推出的基因分析工具MassARRAY(?)分子量阵列技术进行各SNP位点的基因型检测。该技术通过将引物延伸,切割反应与灵敏、可靠的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)技术相结合实现基因分型检测。首先通过PCR扩增出含有SNP位点的一段DNA(SNP位点前后各50bp左右),然后用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,然后加入一单碱基延伸引物,其3’末端碱基紧挨SNP位点,采用四种2’,3’-双脱氧核苷酸(Dideoxynucleotide, ddNTP)替代dNTP。这样,探针在SNP位点处仅延伸一个碱基,连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。最后用MALDI-TOF MS检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异以确定该点处碱基,进而确定该SNP位点的基因型。(4)统计学处理：病例组、对照组间年龄比较在SPSS17.0软件上使用独立样本t检验,病例组、对照组间性别分布比较在SPSS17.0软件上使用χ2检验。在SPSS17.0软件上使用拟合优度χ2检验对对照组各SNP位点进行哈迪温伯格平衡检验,以P>0.05作为群体SNP位点分布符合哈迪温伯格平衡的标准。在SPSS17.0软件上使用χ2检验对病例组、对照组间单个SNP位点等位基因频率差异进行比较。在SNPstats在线软件上(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)使用非条件Logistic回归分析在五种不同遗传模式下(共显性遗传、显性遗传、隐形遗传、超显性遗传、加性遗传)分析各个SNP位点与精神分裂症的相关性。针对本研究存在的多重检验问题,采用错误发现率(False Discovery Rate, FDR)标准下的BH(Benjamini-Hochberg)法进行多重校正。使用Haploview 4.2软件分析同一个基因不同SNP位点间的连锁不平衡。在Haploview 4.2软件上进行单倍型块设定,并在病例组、对照组间比较单倍型块中不同单倍型做与精神分裂症的相关性。精神分裂症患者同一个SNP位点不同基因型之间临床特征的比较使用SPSS17.0软件,分类变量选择χ2检验；连续变量若数据分布符合正态分布选择单向方差分析,数据分布不符合正态分布则选择Kruskal-Wallis H多组秩和检验。结果1 NDEL1基因SNP位点多态性与精神分裂症的关联分析：(1)等位基因频率与精神分裂症的关联分析：对所选5个NDEL1基因SNP位点的等位基因频率进行病例对照分析,结果显示各SNP等位基因频率在病例组和对照组间无显著性差异。病例组和对照组性别分层后,对男性群体和女性群体分别进行等位基因频率病例对照分析,结果显示各SNP等位基因频率在不同性别病例、对照人群中均无显著性差异。(2)基因型分布与精神分裂症的关联分析：挑选每个SNP位点AIC和BIC数值最小的遗传模型为该SNP可能的遗传模型,对此遗传模型对应的P值采用基于FDR的BH法进行校正,得到FDR校正P值PFDR。结果显示校正后rs17806986基因型分布在超显性遗传模式下仍与精神分裂症存在显著相关(PFDR=.027, OR=2.96,95% CI:1.42-6.17),说明G/C基因型可显著增加精神分裂症的患病风险,该位点基因型为G/C的携带者患精神分裂症的风险是基因型为G/G和C/C的携带者的2.96倍。其余SNP位点校正后与精神分裂症均无显著相关性。将病例组和对照组进行性别分层后,对男性群体和女性群体分别分析rs17806986位点基因型分布与精神分裂症的相关性。结果显示,男性人群中rs17806986位点基因型分布在超显性遗传模式与精神分裂症显著相关(P=0.015,基因型G/C相对于G/G和C/C,oR=3.26,95%CI:1.22-8.72).说明在男性人群中rs17806986基因型G/C的携带者患精神分裂症的风险是基因型为G/G和C/C的3.26倍。女性人群中,rs17806986基因型分布与精神分裂症无相关性。(3)连锁不平衡检验及单倍型关联分析：5个SNP中,rs17806986与其余四个SNP间r2均小于0.33,提示rs17806986与其余四个SNP间LD程度非常弱,rs8065812, rs1391766, rs8064655, rs931672彼此间r2均接近1,提示这四个SNP之间几乎完全连锁。rs8065812, rs1391766, rs8064655, rs931672等4个SNP构成一个单倍型块,主要由CGCC和TCTT两个单倍型构成,在总人群及男性,女性人群中,两个单倍型CGCC和TCTT与精神分裂症均无显著相关性。(4)精神分裂症患者rs17806986位点不同基因型临床特征比较：CC, CG, GG三种基因型的精神分裂症患者的首发年龄、住院次数、家族史及临床分型均无显著性差异。2 PCM1基因SNP位点多态性与精神分裂症的关联分析：(1)等位基因频率与精神分裂症的关联分析：对从PCM1基因中选取的5个SNP位点的等位基因频率进行病例对照分析,结果显示各SNP位点等位基因频率在病例组和对照组间均无显著性差异。将病例组和对照组按照不同性别进行分层后,对男性群体和女性群体分别进行等位基因频率病例对照分析,结果显示各SNP等位基因频率在不同性别病例、对照人群中均无显著性差异。(2)基因型分布与精神分裂症的关联分析：rs2285310, rs208062, rs208022, rs208756位点在5种不同的遗传模式下与精神分裂均无显著性相关。rs13276297位点由于仅检测C/C, T/C两种基因型,未检测到T/T基因型,无法按照上述5种遗传模式进行分析,故直接使用非条件Logistic回归方法(SNPstats软件)对其两种基因型进行分析。结果显示rs13276297基因型分布与精神分裂无显著性相关。将病例组和对照组按照不同性别进行性别分层后,分别分析男性人群和女性人群SNP位点基因型分布与精神分裂症的相关性,结果显示不同性别人群中5个SNP位点的基因型分布在5种遗传模式下与精神分裂症均不存在显著性关联。(3)连锁不平衡检验及单倍型关联分析：5个SNP中rs208756-rs2285310(r2=0.71),rs208756-rs208022 (r2=0.56), rs208022-rs2285310 (r2=0.37)呈强连锁不平衡,其他SNP位点间不存在或仅存在较弱的连锁不平衡。5个SNP间未构成任何单倍型块,无法进行单倍型病例对照分析。结论(1) NDEL1基因可能是中国南方汉族人精神分裂症的易感基因之一,其位于1号内含子的rs17806986位点的基因型分布与精神分裂症存在显著关联,G/C基因型使精神分裂症患病风险增加2.96倍,且这种相关性仅见于与男性人群,女性人群中无此相关性。精神分裂症患者rs17806986位点不同基因型之间性别、首次发病年龄、住院次数、有无家族史、精神分裂症临床分型等临床特征均无显著性差异。(2)欧洲人群中PCM1基因内与精神分裂症显著关联的SNP位点rsl3276297多态性在中国南方汉族人中与精神分裂症无显著性关联。4个PCM1基因标签SNP位点的等位基因频率、基因型分布在病例组和正常对照组之间均无显著性差异。PCM1基因可能不是中国南方汉族人精神分裂症的易感基因。