白血病是血液系统最常见的恶性疾病，近年来白血病的发病率呈逐渐上升的趋势。上世纪末期逐渐完善的诱导缓解化疗和支持对症治疗已可以使绝大多数的患者达到完全缓解(Complete Remission，CR)；白血病的治疗目前面临的主要问题是：有一小部分患者因原发耐药导致初次诱导缓解治疗无效不能达到完全缓解；初次诱导缓解治疗有效能达到完全缓解的病人则还面临着残留白血病细胞的继发耐药所导致的复发，这一问题是目前白血病临床治疗中，也是其它肿瘤临床治疗中所面临的最大难题；因此激发患者自体的免疫功能以杀灭白血病细胞／肿瘤细胞的肿瘤疫苗成为肿瘤治疗研究的热点。免疫治疗在肿瘤或白血病的治疗中一直处于辅助治疗的地位，至今没有特别有效的免疫治疗能应用于临床。研究显示肿瘤细胞、肿瘤细胞可溶性抗原、肿瘤细胞蛋白质或蛋白肽以及肿瘤细胞RNA／DNA都携带有肿瘤抗原和／或肿瘤相关抗原，可以作为肿瘤疫苗刺激机体产生抗肿瘤免疫反应；但其免疫原性往往比较弱，目前还难以真正应用于临床解决白血病或肿瘤治疗中所面临的问题。树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的唯一能激活初始型T细胞(naive T cells)并诱导特异性免疫应答的抗原呈递细胞，目前的研究结果提示激活的T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)介导的适应性免疫应答在机体抗白血病效应中起关健作用。用白血病抗原负载的树突状细胞作为“抗白血病治疗性疫苗”的效果已得到了验证，但是目前还有很多相关的诸如树突状细胞的来源和功能维持等问题没有解决，如树突状细胞疫苗需要大量的树突状细胞，功能难以保持，并且难以制定GMP(Good Manufacturing Practice)生产标准，不宜保存等客观问题制约着树突状细胞疫苗的研究和应用。L．Zitvogel和G．Raposo等研究小组的研究结果显示肿瘤抗原冲击后的树突状细胞来源exosomes(DEX)和树突状细胞一样能诱导明显的抗肿瘤免疫反应，产生有效的免疫保护和治疗作用，提示exosomes可能是更有潜能的肿瘤治疗型性疫苗。exosomes是一种直径在30-100nm范围有双层膜的囊泡小体，可由多种细胞分泌，并且携带有所有抗原呈递所需的物质分子，包括MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子CD86、CD80、以及黏附分子CD54、CD11c和CD1a-d；肿瘤细胞来源的exosomes(TEX)除携带有MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子、共刺激分子和粘附分子等抗原呈递所需要的分子外，还携带有和细胞靶向相关的CD9分子以及肿瘤抗原运载系统热休克蛋白分子(蛋白分子伴娘，hot shock protein，HSPs)，同时也携带有许多肿瘤细胞所共有的共同抗原和肿瘤相关抗原，能把肿瘤抗原转运给专职的抗原递呈细胞和效应细胞，从而激活体内的抗肿瘤免疫反应并放大这种免疫反应，产生对肿瘤的排斥效应。另外和DC疫苗相比exosomes还具有耐高温、可长期冷藏、定量分析和易于制定GMP生产标准等优点，因而被认为是新的抗原传送和呈递的载体，同时也是更有潜能的肿瘤治疗性疫苗。目前对exosomes的研究尚处于初始阶段，国内还未见在白血病方面的研究报道。而且根据文献报道，急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)细胞和慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)细胞可以直接诱导分化成树突状细胞，这些树突状细胞既具备了白血病细胞的特点，同时又具有树突状细胞的特点和功能，其外泌的exosomes也应该具有树突状细胞来源exosomes和肿瘤细胞来源exosomes的双重特性；而且和实体肿瘤相比，白血病细胞取材更为便捷，更方便研究和应用。基于此本课题研究了白血病细胞来源exosomes诱导的CTL的抗白血病作用。实验方法第一部分K562细胞来源exosomes体外诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用1．K562细胞诱导分化树突状细胞(K562-DCs)的诱导和鉴定根据文献报道的方法，用含有重组人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhIL-4)及肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)的RPMI-1640细胞营养液培养K562细胞诱导树突状细胞生成。在倒置显微镜下动态观察细胞的形态变化；流式细胞仪检测培养前后细胞表面CD34、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86和CD54等树突状细胞标志分子的表达；电镜下观察并摄像其典型形态。2．K562细胞和K562-DCs分泌exosomes的提取和鉴定收集对数生长期的K562细胞培养上清液和培养第12-14天的K562-DCs的培养上清液，根据文献报道的多步骤离心获取exosomes的方法，通过低速离心、高速离心去除细胞培养上清液中的细胞和细胞碎片等杂质，再把上清液经过100，000g超高速离心1小时，获取的沉淀即为exosomes。紫外分光光度仪对exosomes进行蛋白定量，经12％SDS-PAGE电泳观察蛋白带型，western blot检测所携带的标志性分子；电子显微镜下观察其形态特征。3．K562细胞来源exosomes诱导CTL对K562细胞和HL60细胞的杀伤作用用K562细胞来源exosomes(Kexo)刺激正常人外周血单个核细胞诱导分化的树突状细胞(MC-DCs)作为实验组，未刺激组做为对照组，然后分别诱导正常人T淋巴细胞产生CTL，MTT法检测两组CTL对K562细胞和HL60细胞的杀伤作用。4．不同K562细胞exosomes诱导CTL对K562细胞的杀伤作用分别用K562细胞源exosomes(Kexo)、K562-DCs源exosomes(DCexo)、热休克K562细胞源exosomes(Hexo)、K562细胞冻融抗原和K562细胞总RNA抗原冲击K562-DCs源exosomes(Rexo、Fexo)刺激正常人MC-DCs，并进一步诱导活化CTL效应细胞，MTT法检测CTL效应细胞对K562细胞的杀伤作用。5．不同K562细胞exosomes联合CPG佐剂诱导CTL对K562细胞的杀伤作用同上方法检测K562细胞来源exosomes(Kexo)、K562-DC分泌exosomes(DCexo)和RNA抗原冲击K562-DC exosomes(Rexo)单独或联合CpG ODN佐剂后诱导CTL对K562细胞的杀伤活性。第二部分CKLFSF8基因转染对K562细胞、K562-DCs及分泌exosomes的影响1．CKLF、CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs中的表达，首先采用免疫组化方法用CKLF单抗检测CKLF在K562细胞和K562-DC中的表达，再分别提取K562细胞和K562细胞总RNA抗原荷载K562-DCs后的RNA，根据CKLFSF8基因特异性引物，采用RT-PCR方法观察CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs中的表达。2．CKLFSF8基因转染对K562细胞和K562-DCs及其分泌exosomes的影响用脂质体转染试剂把携带CKLFSF8基因片段的pcDNA3.1质粒转染到K562细胞和K562-DCs中，倒置显微镜下观察细胞生长，MTT法检测细胞增殖状态，免疫细胞化学法检测细胞表面EGFR(EGF受体)的表达，并提取相应细胞培养上清液中的exosomes，经12％SDS-PAGE电泳观察蛋白带型，western blot鉴定所携带exosomes的标志性分子，电子显微镜下观察其形态特征及其分泌的变化。第三部分CML患者原代白血病细胞源exosomes诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用1．CML患者原代白血病细胞来源exosomes诱导CTL对患者白血病细胞的杀伤作用CML患者抗凝外周血梯度离心获取原代白血病细胞并培养，同第一部分方法获取CML患者原代白血病细胞来源exosomes(Pexo)，MTT法检测K562细胞来源exosomes(Kexo)和Pexo诱导的患者CTL对患者原代白血病细胞的杀伤作用。2．不同方法获取的Pexo诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用同第一部分方法MTT法检测CML患者Pexo、CML患者原代白血病细胞诱导分化树突状细胞来源exosomes(PDCexo)和患者白血病细胞冻融抗原刺激白血病细胞诱导分化树突状细胞来源exosomes(PFexo)单独或联合CPG ODN佐剂诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用3．PFexo诱导同种异体CTL对患者白血病细胞的杀伤作用取患者治疗后正常自体和HLA完全相合同胞外周血单个核细胞诱导培养树突状细胞，诱导培养第5天分别加入终浓度为20ug／ml的PFexo继续培养48小时，再分别加入同源T淋巴细胞诱导CTL生成，MTT法检测对患者白血病细胞的杀伤作用。实验结果第一部分K562细胞来源exosomes体外诱导的CTL对白血病细胞的杀伤作用1．K562细胞可诱导分化成树突状细胞我们的实验证实K562细胞经rhGM-CSF、rhIL-4和rh TNF-α诱导培养到12-14天时细胞呈典型的树突状细胞形态，透射电镜下可见到由细胞胞浆伸出的长短不一的绒毛样突起，在诱导培养后细胞表面CD34、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD11c、CD54、CD80、CD86和CD40等标志性分子的表达都明显发生改变，呈DC的特点。2．K562细胞及其诱导分化的树突状细胞分泌exosomes从K562细胞培养上清液和K562-DCs培养上清液中都能分离到exosomes(Kexo，DCexo)，SDS-PAGE电泳分析显示二者有相似的蛋白带型。透射电子显微镜下呈50-90nm大小的膜颗粒。Western blot蛋白分析显示都携带有标志性蛋白分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD86、CD54、CD80和CD40等分子。3．Kexo诱导的CTL对白血病细胞的杀伤作用我们的实验结果提示，Kexo刺激正常人树突状细胞并诱导T淋巴细胞特异性的对K562细胞的杀伤作用，同时对HL60细胞有一定的交叉杀伤作用。4．不同K562细胞来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用不同方法处理K562细胞(诱导分化DCs、K562细胞热休克、K562细胞RNA和冻融抗原刺激K562-DCs)来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作比K562细胞来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用强，而这四种exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用近似。5．CpG ODN佐剂能增强exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用。Exosomes能诱导有效的CTL对K562细胞的杀伤作用，联合应用CpG ODN Th1型免疫佐剂后，进一步增强了其杀伤作用。第二部分CKLFSF8基因转染对K562细胞、K562-DCs及分泌exosomes的影响1．CKLF和CKLFSF8在K562细胞和K562-DC中的表达CKLF和CKLFSF8在此两种细胞都有表达，并且在K562细胞RNA抗原荷载前后的K562-DC和K562细胞中的表达没有变化。2．CKLFSF8基因转染对K562细胞和K562-DCs的增殖和exosomes分泌的影响我们采用多种转染试剂转染K562-DC均未能达到满意的转染效果，应用能特异性结合树突状细胞受体的JetPEI-Man转染试剂也只是观察到很低的转染率，没有观察到转染对树突状细胞增殖和分泌exosomes的影响。CKLFSF8基因转染K562细胞后，转染率也很低，未能如期筛选出稳定表达的细胞株，并且导致K562细胞的逐渐死亡，但转染空质粒的细胞没有发现此现象，提示CKLFSF8基因转染导致K562细胞的死亡，进一步对多种其它肿瘤细胞的转染试验结果类似。MTT法测定显示转染后的K562细胞增殖受抑，斑点分析显示转染前后外泌的exosomes无明显变化。免疫组化方法检测转染前后K562细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达，发现转染CKLFSF8基因后其表达明显下调，推测CKLFSF8基因转染K562细胞后其增殖受抑制的可能机制是EGFR表达下调导致K562细胞生长信号传导受抑最终导致细胞的死亡。第三部分CML患者原代白血病细胞源exosomes诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用1．Pexo诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用对CML患者原代白血病细胞来源exosomes(Pexo)诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用的研究显示：Pexo的免疫原性和Kexo有所不同，Pexo诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用比Kexo诱导的更强。PDCexo和PFexo与Pexo相比有更强的免疫原性，联合CpG免疫佐剂可以进一步增强exosomes诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用。2．PFexo刺激同种异体树突状细胞诱导的CTL的抗白血病细胞作用患者原代白血病细胞冻融抗原刺激患者白血病细胞诱导分化的树突状细胞来源exosomes(PFexo)分别刺激自体正常及HLA完全相合同胞的MC-DCs和淋巴细胞诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用明显不同，PFexo诱导的同胞CTL对患者白血病细胞的杀伤作用比自体的更强。讨论白血病的治疗目前面临的最大难题是临床医师对耐药的患者没有有效的应对方法，这类患者很难达到长生存。由于白血病免疫治疗的效果还很有限，临床上免疫治疗一直是作为辅助治疗来进行的，但对免疫治疗的探索并没有停止过。近些年对树突状细胞的大量研究证明树突状细胞疫苗对恶性肿瘤的治疗作用是肯定的，但是树突状细胞作为肿瘤治疗性疫苗还存在诸如来源和功能维持等许多问题尚未解决，难以广泛应用。而近些年有关exosomes的研究结果则让我们看到了新的白血病免疫治疗的曙光，几组动物体内和临床实验结果都显示：肿瘤抗原荷载的树突状细胞来源的exosomes可以诱导产生比较好的对肿瘤的预防和治疗效果，而且exosomes更具备了耐高温、可长期冷藏和易于定量等优点，克服了树突状细胞疫苗的一些缺点，尽管目前对exosomes在体内的生理和病理生理作用还不甚明了，还需要进行大量的研究工作，但其作为无细胞治疗性疫苗的潜能是明显的。目前很少有关exosomes在白血病方面的研究报道，白血病细胞可以诱导分化成树突状细胞，具备了肿瘤细胞和树突状细胞的双重特点，并且白血病细胞取材更为便利，更利于研究和应用。基于此我们研究了白血病细胞来源exosomes诱导的杀伤白血病细胞的作用。我们的结果显示K562细胞可以诱导分化成树突状细胞，K562细胞及其诱导分化的树突状细胞分泌的exosomes携带有MHC分子和共刺激分子等抗原呈递所必需的分子，体外能诱导T淋巴细胞产生对K562白血病细胞特异性的CTL杀伤作用和对HL60白血病细胞的交叉杀伤作用。进一步的试验发现K562细胞经过热休克处理、诱导分化成树突状细胞和冻融抗原或RNA抗原冲击K562-DCs后分泌的exosomes能更有效地诱导这种杀伤作用。联合应用CpG ODN佐剂能进一步促进这种杀伤作用。对患者自体原代白血病细胞来源exosome的研究显示，和K562细胞来源的exosomes相比，它诱导的对患者原代白血病细胞的杀伤作用更为明显。患者原代白血病细胞诱导分化树突状细胞来源的exosomes或白血病细胞冻融抗原冲击患者白血病细胞诱导分化树突状细胞源exosomes能诱导比原代白血病细胞来源exosomes更强的杀伤活性。联合CpG佐剂其诱导的杀伤作用进一步增强。患者白血病细胞冻融抗原刺激患者白血病细胞诱导分化的树突状细胞来源exosomes(PFexo)分别刺激自体和HLA完全相合同胞的淋巴细胞诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用明显不同，同胞CTL的杀伤作用更强。提示这些白血病细胞源exosomes都是很好的备选exosomes治疗性疫苗的来源，在对其有了全面的了解和认识后，有望作为白血病治疗性疫苗用于白血病的临床治疗。为了观察趋化因子样细胞因子超家族成员8(CKLFSF8)对exosomes质和量的影响，以探寻更为有效的exosomes来源，我们进一步对CKLF和CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs表达的研究未能达到预期目的，我们的研究发现，CKLF和CKLFSF8在K562细胞及其诱导分化树突状细胞中均有表达。把CKLFSF8基因转染到K562细胞没有如期筛选出稳定表达的细胞株，发现CKLFSF8基因转染抑制K562细胞生长，转染其它细胞如Eca109、HL60、BGC823后也观察到类似的结果，推测CKLFSF8在肿瘤细胞中的表达可能有更微妙的机制，通常的表达可能和细胞的生物活性有关，是细胞生长所必须的，不抑制细胞的生长；但过度表达则可能抑制细胞的生长。进一步用免疫组化分析细胞表面的EGFR的表达，发现CKLFSF8基因转染后EGFR的表达显著下降，推测可能是白血病细胞或肿瘤细胞增殖能力减低的原因。转染CKLFSF8基因后的K562细胞分泌的exosomes质和量无变化，推测可能与设定的检测指标有关，也可能还和其它因素有关，还有待深入的研究。结论：1．K562白血病细胞和慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞均可以诱导分化成树突状细胞，并且白血病细胞和白血病树突状细胞均分泌exosomes。2．白血病细胞和白血病树突状细胞分泌的exosomes携带有抗原呈递所需要的物质分子，并且有抗原呈递功能，可以诱导淋巴细胞活化产生对白血病细胞的特异性和交叉杀伤作用。CpG ODN免疫佐剂可以增强exosomes诱导的免疫应答的强度。3．CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs都有表达，K562细胞在CKLFSF8基因转染前后都能分泌具有抗原提呈功能的exosomes并刺激T细胞活化。转染后CKLFSF8在K562细胞的过表达使其细胞表面EGFR表达下调，并且直接抑制白血病细胞的生长。4．Exosomes有希望用于白血病的免疫治疗。